房鵬金，齊冉，趙志龍，張慧珍

(臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276000)

隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致多藥耐藥菌株頻發(fā)，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來(lái)，將兩種或兩種以上的臨床藥物聯(lián)用所產(chǎn)生的協(xié)同作用，常能克服多藥耐藥性，并提高藥效和生物利用度。然而，對(duì)新型抗微生物藥物的研發(fā)仍迫在眉睫，是藥物化學(xué)家面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

四唑化合物作為一種重要的多氮芳雜環(huán)，能夠發(fā)生多種非共價(jià)鍵相互作用，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化學(xué)、超分子等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景[1-2]。因此，四唑化合物的合成和應(yīng)用研究工作眾多。值得一提的是，四唑類化合物不僅在醫(yī)藥領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用[3-4]，如抗高血壓藥物奧美沙坦酯、坦坎地沙坦酯以及抗生素頭孢雷特等，在農(nóng)藥領(lǐng)域[5-6]如除草劑四唑嘧磺隆，而且在材料領(lǐng)域[7-8]，由于四唑類化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、含氮量高且生成焓高的特點(diǎn)，在起爆藥、固體推進(jìn)劑等含能材料的制備中應(yīng)用普遍，此外，其在燃料電池、抗金屬腐蝕、光敏材料和化學(xué)催化劑等方面的研究也較為活躍。因而，其廣泛的潛在應(yīng)用吸引了越來(lái)越多的努力致力于四唑類化合物的合成研究。

氨基四唑類化合物作為四唑類化合物的重要一員，其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用同樣吸引了無(wú)數(shù)研究致力于其合成研究[9]?；谡n題組對(duì)唑類抗微生物化合物的研究，我們意外分離得到了氨基四唑環(huán)開環(huán)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)物(見(jiàn)圖1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)X-射線單晶衍射，并考察了所合成化合物的體外抗細(xì)菌抗真菌活性，與臨床藥物的聯(lián)用效果，以及與小牛胸腺DNA的相互作用。

圖1 氨基四唑的開環(huán)反應(yīng)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 核磁共振儀(Bruker AV 300核磁共振儀)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；臺(tái)式恒溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療機(jī)械廠)；X-射線單晶衍射儀(日本理學(xué)Gemini E型單晶衍射儀，北京理化賽思科技有限公司)。

硅膠(青島海洋化工廠)；乙酰苯胺(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯磺酸、5-氨基四唑無(wú)水K2CO3、無(wú)水Na2SO4均為天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷、丙酮、氯仿均為天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氟康唑(富陽(yáng)金伯士化工有限公司)；諾氟沙星(重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司)；氯霉素(四川泰華堂制藥有限公司)；小牛胸腺DNA(北京百泰生物技術(shù)公司)。

1.2 合成或制備

1.2.1 4-乙酰氨基苯-1-磺酰氯(4-acetamidobenzene-1-sulfonyl chloride)2的合成 在冰浴條件下，向化合物乙酰苯胺1(10.002 g,0.074 1 mol)中逐滴加入25 mL氯磺酸，攪拌至固體完全溶解后，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至60 ℃油浴中，繼續(xù)反應(yīng)2 h，冷卻至室溫.緩慢將反應(yīng)體系倒入碎冰中，會(huì)產(chǎn)生大量的白色固體，抽濾，烘干濾餅得到白色固體2為16.212 g。

1.2.2 目標(biāo)化合物3的合成 稱取5-氨基四唑(3.658 g,0.043 mol)與無(wú)水碳酸鉀(7.031 g,0.051 mol)于100 mL圓底燒瓶中，加入適量丙酮50 mL做溶劑，在50 ℃下攪拌反應(yīng)1 h后，冷卻至室溫.然后加入化合物2(10.008 g,0.043 mol)，繼續(xù)室溫下攪拌。用薄層色譜(展開劑:二氯甲烷/丙酮，5/1，體積比)跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸出大部分丙酮后，加水30 mL，用氯仿(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，經(jīng)柱色譜分離(展開劑：二氯甲烷/丙酮，5/1，體積比)，析出塊狀無(wú)色透明晶體3，產(chǎn)率約70%。1H-NMRδ:11.32(s,1H,NH),10.32(s,H,NHCOCH3),7.82(d,2H,J=4.0 Hz,Ph-2,6-H),7.76(d,2H,J=4.0 Hz,Ph-3,5-H),2.09(s,3H,COCH3)。

1.4 抗細(xì)菌抗真菌活性測(cè)試 采用美國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)[10]推薦的藥敏實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行化合物的抗細(xì)菌抗真菌活性測(cè)試。首先，二甲基亞砜(DMSO)溶解化合物和參考藥物，配成 12.8 mg·mL-1溶液，并用無(wú)菌肉湯稀釋至1 024 μg·mL-1。在無(wú)菌96孔板的每個(gè)孔中均加入100 μL菌液，采用倍比稀釋法，將受試藥液加入96孔板中的1～11號(hào)孔，使各孔中的藥物濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 和 0.5 μg·mL-1，12號(hào)孔不含藥物，作陽(yáng)性對(duì)照，此時(shí)，各孔中DMSO含量均低于1%，排除了溶劑DMSO對(duì)活性測(cè)試結(jié)果的影響。將96孔板在37 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。

1.5 化合物與臨床藥物聯(lián)用活性測(cè)試 根據(jù)所測(cè)得的化合物3以及臨床藥物對(duì)測(cè)試細(xì)菌和真菌的MIC值，采用棋盤法，測(cè)定化合物與臨床藥物聯(lián)用時(shí)，對(duì)細(xì)菌或真菌的抑制能力。聯(lián)合作用效果用FIC指數(shù)來(lái)表征。FIC指數(shù)= 聯(lián)合用藥后化合物的MIC值/聯(lián)合用藥前化合物的MIC值 + 聯(lián)合用藥后臨床藥物的MIC值/聯(lián)合用藥前臨床藥物的MIC值。 FIC≤1，兩者為協(xié)同作用；12，兩者之間為拮抗作用[11]。

1.6 化合物與小牛胸腺DNA相互作用研究 采用紫外-可見(jiàn)光譜法初步研究化合物3與小牛胸腺DNA的相互作用。通過(guò)化合物3和小牛胸腺單獨(dú)存在時(shí)吸光度之和和共存時(shí)吸光度值進(jìn)行比較，增色性是由于破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)引起的，化合物嵌插入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)則造成吸光度降低。

2 結(jié)果與討論

2.1 晶體結(jié)構(gòu) 化合物3溶于二氯甲烷和丙酮的混合溶液中，其單晶是在室溫下隨著溶劑緩慢蒸發(fā)而生長(zhǎng)的?；衔?的主要晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)和氫鍵數(shù)據(jù)見(jiàn)表1～2。

表1 化合物3的晶體學(xué)數(shù)據(jù)

表2 化合物3中氫鍵的鍵長(zhǎng)、鍵角數(shù)據(jù)

注：對(duì)稱性操作代碼：(i)x,y,z-1;(ii)-x+1,-y+2,-z+1;(iii)x,y+1,z;(iv)-x,-y+2,-z+1

圖2是化合物3的晶體結(jié)構(gòu)，從圖中可以看出化合物含有一個(gè)結(jié)晶水，以水合物形式存在。化合物3分子間通過(guò)氧原子、乙酰氨基氮原子和氨基氮原子形成氫鍵，進(jìn)而形成三維超分子結(jié)構(gòu)，其沿a方向的空間堆積圖如圖3所示。

圖2 化合物3的晶體結(jié)構(gòu)圖

圖3 化合物3垂直于a軸方向的三維堆積圖

2.2 抗細(xì)菌抗真菌活性 化合物2和3的體外抗細(xì)菌、抗真菌數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。測(cè)試的細(xì)菌有：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種，和白色念珠菌、假絲酵母菌以及黃曲霉菌3種真菌。活性測(cè)試中分別選用氯霉素、諾氟沙星和氟康唑作為參考藥物。

表3 化合物2和3的抗細(xì)菌和抗真菌活性(MIC,g·mL-1)

體外抗細(xì)菌和抗真菌活性結(jié)果表明：化合物2和3對(duì)所測(cè)試的細(xì)菌和真菌表現(xiàn)出弱到中等(MIC=64～256 μg·mL-1)的抑制活性.與參考藥物氟康唑相比，化合物對(duì)耐氟康唑的黃曲霉菌的抑制活性強(qiáng)于氟康唑(MIC=256 μg·mL-1)。

2.3 化合物與臨床藥物聯(lián)用活性 化合物3與臨床藥物氯霉素或諾氟沙星的聯(lián)用抗細(xì)菌活性結(jié)果如表4所示。當(dāng)氯霉素濃度為2～4 μg·mL-1或諾氟沙星濃度為0.25～1 μg·mL-1時(shí)，與化合物3聯(lián)用即可顯示有效的抗細(xì)菌活性，較單獨(dú)用藥時(shí)，劑量顯著減少，抗菌能力明顯增強(qiáng).所有聯(lián)用體系的FIC指數(shù)均小于1，顯示較好的協(xié)同作用效果。

表4 化合物3和抗細(xì)菌藥氯霉素或諾氟沙星的聯(lián)用效果

臨床藥物氟康唑與化合物3的聯(lián)用抗真菌活性結(jié)果(見(jiàn)表5)表明，化合物3與氟康唑的聯(lián)用體系顯示較好的抗白色念珠菌、假絲酵母菌和黃曲霉菌活性。當(dāng)氟康唑濃度為0.25～1 μg·mL-1時(shí)，與一定濃度的化合物3(16～64 μg·mL-1)聯(lián)用，即可顯示較好的抗真菌活性。特別是對(duì)于耐氟康唑的黃曲霉菌，聯(lián)用體系給出較好的抑制作用。因此，有望通過(guò)氟康唑與化合物的聯(lián)用，拓寬氟康唑的抗真菌譜，改善其因用藥劑量大而導(dǎo)致的毒性和耐藥性等問(wèn)題。

表5 化合物3和抗真菌藥氟康唑的聯(lián)用效果

2.4 化合物與小牛胸腺DNA的相互作用 DNA作為生物體中的重要生物大分子，對(duì)各種生命活動(dòng)有著非常重要的作用，而且，其作為眾多臨床藥物的主要靶分子，引起了廣泛的關(guān)注?；衔锱cDNA的相互作用研究能夠?yàn)樾滦虳NA靶標(biāo)藥物的設(shè)計(jì)提供重要的理論指導(dǎo)。小牛胸腺DNA因其價(jià)廉易得等，而被普遍選擇為研究的模型。利用紫外-可見(jiàn)光譜法研究了化合物3與小牛胸腺DNA的相互作用，初步從分子水平上探討了其可能的抗微生物作用機(jī)制[12]。

一般認(rèn)為，DNA吸收光譜的減色紅移現(xiàn)象是由于化合物與DNA發(fā)生了嵌插作用，其芳香發(fā)色團(tuán)與DNA的堿基對(duì)發(fā)生強(qiáng)烈的堆積，形成了DNA-化合物復(fù)合物導(dǎo)致；而增色性則是因?yàn)镈NA雙鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞引起[13]。在圖4中，隨著化合物3濃度的增加，在260 nm處的DNA的吸光度比例增大?；衔?-DNA復(fù)合體系的吸光度值稍小于相應(yīng)濃度的游離的化合物和DNA的吸光度之和(見(jiàn)圖5)，說(shuō)明DNA的吸收光譜顯示減色效應(yīng)，其可能是因?yàn)榛衔?嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成大的共軛體系引起[14]。

圖4 DNA在不同濃度的化合物3存在下的紫外吸收光譜(pH=7.4,室溫)

圖5 260 nm處3-DNA復(fù)合物的吸光度以及游離的DNA與游離化合物3的吸光度之和

根據(jù)在化合物3存在下，DNA吸收光譜的變化，可用方程(1)分析計(jì)算DNA與化合物的結(jié)合常數(shù)K[15]。

(1)

A0和A分別代表沒(méi)有和有化合物3存在下的DNA吸光度值，ξC和ξD-C表示化合物3和3-DNA體系的吸收系數(shù)，根據(jù)方程和吸收滴定擬合曲線圖，可計(jì)算出相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)K=1.14×104L·mol-1，r=0.999，SD=0.08。

中性紅(NR)可嵌插入DNA結(jié)構(gòu)中，而且其本身毒性很低，水溶液可長(zhǎng)時(shí)間放置。因此，選用中性紅作為光譜探針研究化合物3與DNA的相互作用模式。圖6顯示了NR染料在DNA加入過(guò)程中的吸收光譜變化。結(jié)果表明，隨著DNA濃度的增加，NR在460 nm附近的吸收峰逐漸減小，而在530 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，這歸因于新的DNA-NR復(fù)合物的形成，在504 nm處的等色點(diǎn)為DNA-NR復(fù)合物的形成提供了證據(jù)[16]。

圖6 中性紅在不同濃度DNA下的紫外吸收光譜(pH=7.4,T=室溫)

圖7顯示了中性紅和化合物3與DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的吸收光譜。隨著化合物3濃度的增加，最大吸收峰在530 nm的DNA-NR復(fù)合物的吸收下降，而在460 nm處的吸收略微增強(qiáng)，與隨著DNA濃度增加時(shí)游離NR在460 nm左右的吸收相比(見(jiàn)圖6)，圖7中的吸收光譜顯示出相反的過(guò)程。因此，化合物3可能插入到DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，代替NR，與DNA發(fā)生絡(luò)合，形成化合物3-DNA復(fù)合物。

圖7 DNA在中性紅與化合物3競(jìng)爭(zhēng)下的紫外吸收光譜

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用5-氨基四唑1和4-乙酰氨基苯磺酰氯2反應(yīng)得到四唑開環(huán)化合物3，其結(jié)構(gòu)經(jīng)X-射線單晶衍射證實(shí)。結(jié)果表明，5-氨基四唑斷鍵開環(huán)生成疊氮化物3含有一個(gè)結(jié)晶水分子，屬于P-1空間群，晶胞參數(shù)a=7.555 4(5)?，b=8.816 3(4)?，c=11.051 6(7)?，=75.46 3(5)，=89.813(5)，=69.166(6)?；衔锿ㄟ^(guò)氧原子、氮原子和氫原子形成氫鍵，進(jìn)而形成三維超分子結(jié)構(gòu)。抗微生物活性測(cè)試結(jié)果顯示，所合成的化合物對(duì)所測(cè)試的細(xì)菌和真菌顯示了較弱到中等(MIC=64～256 μg·mL-1)的抑制活性，與參考藥物氟康唑相比，化合物對(duì)耐氟康唑的黃曲霉菌的抑制活性強(qiáng)于氟康唑(MIC=256 μg·mL-1)。此外，將化合物3與參考藥物聯(lián)用后，所有聯(lián)用體系的FIC指數(shù)均小于1，抗微生物能力明顯增強(qiáng)，減少了用藥劑量，拓寬了抗微生物譜，顯示較好的協(xié)同作用效果。因此，有望通過(guò)化合物與臨床藥物的聯(lián)用，改善其因用藥劑量大而導(dǎo)致的毒性和耐藥性等問(wèn)題。紫外-可見(jiàn)光譜法顯示，化合物3與小牛胸腺DNA共存時(shí)其吸光度值小于單獨(dú)存在時(shí)的吸光度之和，所以化合物3可能通過(guò)嵌入的方式與DNA形成復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)揮抗微生物作用。