孫銅，徐偉娜，冷佳蔚，李永貴

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

加替沙星(Gatifloxacin，GTX)是第四代6-氟-8-甲氧基喹諾酮類抗菌藥物，它對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌、衣原體、支原體、厭氧菌等有較好的抗菌作用，而且?guī)缀鯚o(wú)潛在的光敏副反應(yīng)。0.3%加替沙星滴眼液于2004年3月獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，主要用于細(xì)菌性結(jié)膜炎的治療[1-2]。但是眼部給藥劑型發(fā)揮作用有以下幾點(diǎn)需要克服：首先，眼部給藥輔料及藥物不能對(duì)眼睛造成損傷，對(duì)眼部必須無(wú)刺激；其次，由于眼睛容量小，劑量損失較大，1滴滴眼液的平均劑量約為40 μL，進(jìn)入眼部后，經(jīng)淚液流失溢出后，恢復(fù)至正常淚液體積約為7 μL，這導(dǎo)致藥物在眼部的滯留時(shí)間短，生物利用度低[3]。

眼用原位凝膠，是一種以溶液狀態(tài)給藥，用藥部位在生理?xiàng)l件(包括溫度、pH值和離子)下，制劑中的高分子聚合物對(duì)環(huán)境刺激作出響應(yīng)而發(fā)生相變，形成半固體凝膠狀態(tài)的給藥系統(tǒng)[4-7]。該系統(tǒng)具備一定的生物黏附性，可根據(jù)需要調(diào)整藥物的滯留與釋放，促進(jìn)藥物的吸收，制備簡(jiǎn)單，使用方便。有文獻(xiàn)表明，溫敏原位凝膠多次給藥對(duì)兔眼刺激性小，沒(méi)有對(duì)角膜造成損害，泊洛沙姆對(duì)組織無(wú)明顯損傷，刺激性小，生物相容性好，是常用的溫度敏感性材料[8]。本文采用聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)構(gòu)成的嵌段共聚物泊洛沙姆P407和P188，作為凝膠基質(zhì)，制備了加替沙星眼用溫敏凝膠劑(0.3%)，研究其流變學(xué)特性，通過(guò)透析膜法對(duì)體外釋藥行為進(jìn)行研究。該劑型以滴眼液的形式滴入，在眼部膠凝，形成半固體凝膠，這種給藥系統(tǒng)具有給藥方便、準(zhǔn)確，患者依從性好的特點(diǎn)。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(日本島津)；電子天平(Sartorius BT125D)；透皮吸收儀TT-6(天津市正通科技有限公司)；透析膜(截留相對(duì)分子量為3500，美國(guó)聯(lián)碳公司)；Malven Kinexus 流變儀(Malven儀器公司)；加替沙星對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130518-200402)；加替沙星溫敏凝膠(自制，批號(hào)：160302)；加替沙星滴眼液(自制樣品，批號(hào)：S160302)；乙腈、三乙胺、磷酸均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 加替沙星溫度敏感眼用凝膠流變學(xué)性質(zhì)研究。

2.1.1 觸變性 取凝膠約2 mL置流變儀錐板式模具上，溫度為25.0 ℃，在1 s-1連續(xù)剪切50 s后,立即將剪切速率增大至100 s-1連續(xù)剪切50 s；再將剪切速率恢復(fù)至1 s-1，繼續(xù)剪切50 s。記錄凝膠的動(dòng)力黏度變化情況。本研究采用了三階段法分析樣品的觸變性。試驗(yàn)表明，本品為觸變性較大的流體，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 加替沙星眼用溫敏凝膠觸變性掃描結(jié)果

2.1.2 黏度掃描 分別取凝膠和加替沙星滴眼液約2 mL置流變儀錐板式模具上，用CP4/40轉(zhuǎn)子，設(shè)定初始溫度為0 ℃，以5 ℃·min-1升溫，剪切速率為1 s-1，分別測(cè)定加替沙星眼用溫敏凝膠和滴眼液的黏度變化情況。結(jié)果表明在溫度升高至33 ℃左右，溫敏凝膠的黏度顯著上升，表明加替沙星眼用溫敏凝膠的狀態(tài)發(fā)生了明顯變化，由液態(tài)變?yōu)榘牍腆w狀態(tài)，符合溫敏凝膠的特性。而滴眼液黏度保持不變，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 加替沙星眼用溫敏凝膠和加替沙星滴眼液黏度掃描結(jié)果圖

2.2 體外釋放測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件 采用Agilent XDB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-三乙胺磷酸溶液[三乙胺溶液(1→100)磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0](20∶80)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm，柱溫30 ℃。

精密稱取加替沙星對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 加替沙星對(duì)照品溶液HPLC圖

取體外釋放各時(shí)間點(diǎn)的接收液，作為透過(guò)量測(cè)定的供試品溶液，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 供試品溶液HPLC圖

分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標(biāo)法計(jì)算，得供試品溶液中的藥物濃度。

2.2.2 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖和峰面積。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液12 h穩(wěn)定性良好，峰面積的RSD為0.80%。取供試品溶液(1 h接受液)分別間隔兩個(gè)小時(shí)進(jìn)樣，考察12 h溶液穩(wěn)定性，記錄色譜圖和峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液(1 h接受液)12 h穩(wěn)定性良好，峰面積的RSD為1.01%。

2.2.3 空白干擾試驗(yàn) 制備除加替沙星外的凝膠。取約0.4 g于25 mL量瓶，流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明空白不干擾加替沙星的測(cè)定。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取加替沙星對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋成6.02、12.04、24.08、36.12、48.16、60.21、72.24 μg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品線性溶液，以濃度對(duì)峰面積做線性回歸，得回歸方程：A=10.263X-1.775 4，r=0.999 9，結(jié)果表明，濃度在 6.02～72.24 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取線性測(cè)定項(xiàng)下的48.16 μg·mL-1的溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖和峰面積，考察該方法的重現(xiàn)性。結(jié)果，加替沙星峰面積的RSD為0.72 %。

2.2.6 檢測(cè)限和定量限 精密稱取加替沙星對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并用流動(dòng)相定量稀釋，制成不同倍數(shù)的系列溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得加替沙星定量限為0.32 ng(S/N≈10)，檢測(cè)限為0.10 ng(S/N≈3)。

2.2.7 回收率 分別精密稱取處方量的80%、100%、120%的加替沙星原料藥及相應(yīng)量空白基質(zhì)于燒杯中，攪拌均勻，各精密稱取供試品0.40 g至25 mL量瓶，流動(dòng)相定容至刻度搖勻。另精密稱取加替沙星對(duì)照品約5 mg，置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。測(cè)得平均回收率為98.78%，RSD為1.18 %，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 加替沙星溫度敏感眼用凝膠的體外釋放試驗(yàn)

2.3.1 測(cè)定方法—透析膜法[9]采用Franz擴(kuò)散池，以累積透過(guò)量、滲透速率為檢測(cè)指標(biāo)，考察樣品經(jīng)膜吸收情況。

將新鮮處理的透析膜固定于Franz擴(kuò)散池的供給池和接收池之間。取凝膠約0.2 g均勻涂于膜上層。接收介質(zhì)為人工淚液(取氯化鈉6.7 g，碳酸氫鈉2 g，二水合氯化鈣0.08 g，加水至1 000 mL，即得)。接收池體積為12 mL，內(nèi)徑1.8 cm。擴(kuò)散池外34 ℃水浴循環(huán)，接收池內(nèi)300 rpm恒速攪拌。分別于 0.5、1、2、4、6、8、12 h取樣，每次抽取接收液2 mL，取樣后及時(shí)補(bǔ)加等溫接收介質(zhì)2.0 mL并排除接收室中的氣泡。所取樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后注入液相色譜儀，測(cè)定含量，并計(jì)算樣品在各時(shí)間點(diǎn)的累積溶出率。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

2.3.2 結(jié)果 所得釋藥情況如圖5所示。加替沙星溫敏凝膠2 h累積釋放約為32%，4 h累積釋放約為40%。體外釋藥研究表明加替沙星眼用溫敏凝膠緩釋效果明顯，未出現(xiàn)突釋效應(yīng)，在12 h內(nèi)累積釋藥量達(dá)到61%。

采用Origin8.0軟件將加替沙星溫敏眼用凝膠0.5～12 h累積釋放率的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合，發(fā)現(xiàn)以零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程和Ritger-Pepps方程擬合所得相關(guān)系數(shù)分別為0.875 59、0.895 15、0.970 83和0.990 96，Higuchi方程和Ritger-Pepps方程均能較好地模擬凝膠中藥物的釋放行為，根據(jù)Ritger-Pepps方程的擬合結(jié)果n=0.990 96，說(shuō)明該處方體外釋藥機(jī)制以擴(kuò)散為主。

圖5 加替沙星眼用溫敏凝膠累積釋放度-時(shí)間曲線(n=4)

3 討論

本研究成功制備了一種加替沙星溫敏凝膠，流變學(xué)研究表明，該凝膠在低于25 ℃

下呈液態(tài)，為低黏彈性的牛頓流體，眼部給藥后，可快速膠凝，凝膠強(qiáng)度增大，展示出假塑性流體特點(diǎn)。本品觸變性較大，在低剪切時(shí)有較高黏度；在高剪切時(shí)有較低黏度；再恢復(fù)低剪切時(shí)，黏度也快速恢復(fù)。當(dāng)以液態(tài)滴入眼部，隨著眼瞼的眨動(dòng)，剪切變稀，利于迅速涂布，同時(shí)，因其溫敏特性，導(dǎo)致在用藥過(guò)程中，變?yōu)榘牍虘B(tài)，有利于藥物在眼部的滯留，從而延長(zhǎng)給藥時(shí)間[10]。

本研究采用了透析膜法來(lái)模擬溫敏凝膠在實(shí)際給藥過(guò)程中藥物通過(guò)角膜的釋放過(guò)程。本品體外釋放結(jié)果與Ritger-Pepps方程擬合較好。其體外釋放可長(zhǎng)達(dá)12 h。藥物均勻分散在高分子骨架中，水凝膠骨架遇接受液，快速膠凝，凝膠骨架內(nèi)部藥物緩慢釋放，溶到接受液中，利用擴(kuò)散方式傳遞藥物。同時(shí)，與接受液接觸凝膠層骨架溶蝕，水分向凝膠內(nèi)部滲透，藥物進(jìn)一步得到釋放。釋放前期，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，藥物釋放緩慢，中后期，由于骨架中藥物量的減少，釋藥速率減慢。實(shí)際上，釋藥過(guò)程是凝膠骨架的溶蝕和藥物擴(kuò)散綜合作用的結(jié)果[11-12]。

本品對(duì)眼部刺激性小，獨(dú)特的溫敏特性使藥物在眼部滯留時(shí)間長(zhǎng)，提高藥物的生物利用度，同時(shí)具有緩釋藥物的特點(diǎn)。