趙偉杰，劉靖康，郭旭虹,2，徐益升,2*

(1華東理工大學化工學院，上海200237；2石河子大學材料化工工程技術(shù)中心，新疆 石河子 832003)

復合凝聚體是帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過靜電作用力自組裝形成的液-液相分離產(chǎn)物，通常這些聚電解質(zhì)包括蛋白質(zhì)、樹枝狀大分子、膠束、無機納米粒子、核苷酸和其他聚電解質(zhì)等。復合凝聚體的本質(zhì)是富含聚電解質(zhì)的致密相與“聚電解質(zhì)不足”稀釋相平衡的產(chǎn)物。如果聚電解質(zhì)的線性電荷密度足夠高并且聚合物鏈上的電荷是固定的(猝滅，不可電離)，通常會形成絮凝物或沉淀物而不是凝聚體，而只有當聚電解質(zhì)大分子間靜電相互作用的焓與離子損失的熵適當時，才會共同驅(qū)動復合凝聚體的形成。相對于絮凝物或沉淀物來說，凝聚體擁有以下優(yōu)點：(1)宏觀均勻和結(jié)合緊密的凝聚體處于流動狀態(tài)更易于處理；(2)具有更低的界面張力。凝聚體可應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化[1]和酶固定化[2]。聚電解質(zhì)大分子形成凝聚體的過程受鹽濃度、pH、溫度、聚合物濃度及聚電解質(zhì)自身性質(zhì)(包括分子量和電荷密度、鏈柔性)的影響。

在很多帶電的聚合物系統(tǒng)中觀察到復合凝聚體，例如彈性蛋白多肽類[3]、肝素與聚陽離子[4]、殼聚糖與聚陰離子[5]、貽貝粘性蛋白與透明質(zhì)酸[6]等，其中殼聚糖(Chitosan,CH)和透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)由于其獨特的性質(zhì)，如良好的生物相容性和生物可降解性，而在生物材料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[7]。許多研究小組已經(jīng)對HA/CH復合物進行了研究，例如，HA/CH納米顆?？捎糜谙颊叩乃幬镙斔蚚8]和基因轉(zhuǎn)染[9]，HA/CH水凝膠可用于傷口愈合[10]，HA/CH薄膜用于細胞增殖的[11]。值得注意的是，盡管對靜電相互作用的研究有很多[12-14]，但是對于HA/CH靜電相互作用的研究很少，仍然未了解鹽濃度和pH等環(huán)境因素是如何影響凝聚體形成的，此外，沒有明確的方法可用于分析這些影響。

基于對復合凝聚體流變性能的測試可以直觀體現(xiàn)聚合物的結(jié)合強度，從而研究復合凝聚體的靜電相互作用，再結(jié)合轉(zhuǎn)換系數(shù)在統(tǒng)一架構(gòu)下分析凝聚體對于環(huán)境因素的敏感性，本文以廣泛使用的HA/CH復合凝聚體為模型，通過改變pH的方法來調(diào)控聚合物上的有效電荷密度以及改變鹽濃度來調(diào)控2種聚合物之間的靜電作用大小，通過流變儀測量HA/CH復合凝聚體(質(zhì)量比為1∶1)在不同pH和鹽濃度下的流變行為，再通過引入轉(zhuǎn)換系數(shù)f疊加在不同pH和鹽濃度下的流變學曲線得到HA/CH復合凝聚體在不同時間尺度下的流變行為，以此來分析復合凝聚體對于pH和鹽濃度的敏感性。

1 實驗材料和方法

1.1 試劑與儀器

去離子水，實驗室自制；氯化鈉，上海凌峰化學試劑有限公司；殼聚糖(Mw=50～190 kDa)，sigma；透明質(zhì)酸(Mw=93 kDa)，華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司；鹽酸，氫氧化鈉等分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

CTK48離心機，湖南湘儀集團；DF-101S恒溫加熱集熱式磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；Delta320pH計，梅特勒；MCR501流變儀，Anton-Paar Physical。

1.2 HA/CH復合凝聚體的制備

保持pH為4.0，2種聚合物的濃度均為0.5 mg/mL，分別配制不同鹽濃度(300、400、500、600 mmol/L)的殼聚糖和透明質(zhì)酸溶液各225 mL。

保持鹽濃度為400 mm，2種聚合物濃度均為0.5 mg/mL，分別配制不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)的殼聚糖和透明質(zhì)酸溶液各225 mL。

在相同pH或鹽濃度情況下將殼聚糖和透明質(zhì)酸溶液等體積混合，攪拌10 min，所得樣品靜置至少兩天，然后使用離心機在8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心樣品20 min，去上清液，取下層聚集相即為所需殼聚糖和透明質(zhì)酸復合凝聚體。

流變測量在Anton-Paar MCR501流變儀上進行，使用半徑為25 mm的平行板。測量過程中溫度控制在25 ℃，應(yīng)變0.1%，頻率范圍0.1～100 Hz。在平板周圍滴加制備相應(yīng)樣品時的上清液，以確保測試時樣品的濕潤[15]。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 鹽濃度對HA/CH復合凝聚體流變性能的影響

結(jié)果見圖1。

圖1 不同鹽濃度(pH 4.0，聚合物濃度 0.5 mg/mL)的HA/CH復合凝聚體的儲存/損失模量與頻率的關(guān)系(a)和HA/CH復合物的損耗角與頻率的關(guān)系(b)Fig.1 Storage/loss modulus vs.frequency of HA/CH complex coacervates (a),Damping factors vs.frequency of HA/CH complex coacervates (b) with different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL)

G′為儲能模量，是測試樣品儲存能量的量度，而G″為損耗模量，反映了剪切過程中耗散的能量。在固定頻率下，損耗模量G小于儲能模量G′，復合凝聚體表現(xiàn)得比粘彈性流體更像粘彈性固體。損耗角反映流體消耗能量的特征，其中損耗角正切值tanδ=G″/G′。

圖1a表明：HA/CH復合物凝聚體的G′和G″都隨著鹽濃度的不斷增加呈下降的趨勢，并且在不同鹽濃度下制備的凝聚體具有相似的流變曲線。損耗角正切值與頻率的關(guān)系(圖1b)顯示：隨著鹽濃度的變化，整個損耗角δ呈現(xiàn)出非線性變化的趨勢，在鹽濃度I(M)=400 mmol/L時達到極大值。前面的工作已經(jīng)提到HA/CH復合凝聚體在鹽濃度400 mmol/L情況下濁度達到最大值，此時兩者的結(jié)合最多[16]，耗散能量越多。

不同鹽濃度下復合凝聚體的復粘度與頻率的關(guān)系(圖2)顯示:

所有曲線均顯示復粘度隨頻率呈線性變化。

在同一頻率下，粘度隨著鹽濃度的升高而降低。這是因為鹽解離的陽離子和陰離子會作為聚合物鏈的電荷補充，降低HA/CH復合凝聚體的結(jié)合強度。此外，從復合凝聚體的體積也可以看出，鹽的存在也增加了吸收到復合物中的水量[17]，聚合物鏈的松弛更為容易[18]。

在同一鹽濃度下，在靜止或者低剪切頻率時，聚合物鏈之間相互纏結(jié)，復粘度較大，而隨著剪切頻率不斷增加，較為散亂的鏈狀粒子滾動旋轉(zhuǎn)收縮成團，聚合物鏈發(fā)生定向，伸展和纏繞的逐步解體，靜電結(jié)合的速度小于被破壞的速度，復粘度降低，整個體系顯示出剪切變稀的性質(zhì)[19]。

圖2 不同鹽濃度(pH 4.0，聚合物濃度 0.5 mg/mL)的HA/CH復合凝聚體的粘度與頻率的關(guān)系Fig.2 Complex viscosity vs.frequency of HA/CH complex coacervates with different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL)

2.2 pH對HA/CH復合凝聚體流變性能的影響

在鹽濃度I(M)=400 mmol/L時，結(jié)果(圖3a)表明：隨著pH的不斷增加，HA/CH復合物凝聚體的G′、G″呈上升的趨勢。在固定頻率下，損耗模量G小于儲能模量G′，表明復合凝聚體表現(xiàn)得比粘彈性流體更像粘彈性固體。

圖3b顯示：隨著pH的變化，整個損耗角δ呈現(xiàn)線性變化的趨勢，pH越大，損耗角越??；當pH從3.5升至5.5，HA的解離度越來越大，在5.5時完全解離，但CH的解離度基本不變，HA/CH結(jié)合越多，耗散能量越多，整個復合凝聚體流變曲線G′的增大幅度大于G″的增大幅度，更趨近于粘彈性固體。

不同pH下復合凝聚體的復粘度與頻率的關(guān)系(圖4)表明：復粘度隨頻率幾乎呈線性變化；在相同頻率下，隨著pH升高，粘度也上升。這是由于pH對于聚合物鏈的解離度的影響。當pH在3.5～5.5范圍內(nèi)逐步升高時，HA的解離度也逐步上升。這是因其帶電基團顯著增多，而CH的解離度基本不變[16]，整個體系復合凝聚體的靜電相互作用逐步增強，結(jié)合最緊密。隨著剪切頻率的增強，整個體系呈現(xiàn)出剪切變稀的狀態(tài)。

圖3 不同pH下(I(M) 400 mmol/L，聚合物濃度 0.5 mg/mL)HA/CH復合凝聚體的儲存/損失模量與頻率的關(guān)系(a)和HA/CH復合物的損耗角與頻率的關(guān)系(b)Fig.3 Storage/loss modulus vs.frequency of HA/CH complex coacervates (a),Damping factors vs.frequency of HA/CH complex coacervates(b) with different pH (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL)

圖4 不同pH(I(M) 400 mmol/L，聚合物濃度 0.5 mg/mL)的HA/CH復合凝聚體的粘度與頻率的關(guān)系Fig.4 Complex viscosity vs.frequency of HA/CH complex coacervates with different pH (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL)

2.3 HA/CH復合凝聚體歸一化處理

通過鹽濃度轉(zhuǎn)換系數(shù)fG,I(M)和pH轉(zhuǎn)換系數(shù)fG,pH研究HA/CH復合凝聚體對pH和鹽濃度影響的敏感性。研究[16]表明，pH為4.0時，HA/CH復合物濁度在鹽濃度400 mmol/L時達到最大值，再結(jié)合圖1b可知：在此條件下，HA/CH復合凝聚體的粘度最大，結(jié)合最多，因此在pH=4.0時，設(shè)定鹽濃度400 mmol/L的轉(zhuǎn)換系數(shù)為1，其中鹽濃度轉(zhuǎn)換系數(shù)為：式(2)中：G是模量，N是數(shù)據(jù)個數(shù)。

fG,I(M)=

(1)

上式中：G是模量，N是數(shù)據(jù)個數(shù)，I(M)是鹽濃度。

研究[16]表明，鹽濃度400 mmol/L時，HA/CH復合物濁度在pH>5.0時達到最大值，結(jié)合圖3b，在鹽濃度400 mmol/L時，設(shè)定pH=5.5的轉(zhuǎn)換系數(shù)為1，pH轉(zhuǎn)換系數(shù)為：

(2)

圖5 不同鹽濃度下(pH 4.0，聚合物濃度 0.5 mg/mL，I(M) 400 mmol/L)儲存/損失模量曲線的時間-鹽濃度疊加曲線的曲線作為參考(a)，不同鹽濃度(pH 4.0，聚合物濃度 0.5 mg/mL)轉(zhuǎn)換存儲/損耗模量曲線的轉(zhuǎn)換系數(shù)(b)，HA/CH復合物凝聚體的流變學數(shù)據(jù)的時間-pH疊加曲線(I(M) 400 mmol/L，聚合物濃度 0.5 mg/mL，pH 5.5的曲線作為參考(c)和HA/CH復合凝聚體流變學數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換曲線的轉(zhuǎn)換系數(shù)(I(M) 400 mmol/L，聚合物濃度 0.5 mg/mL)(d)Fig.5 Time-salt superposition of storage/loss modulus curves in different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL,curves in I(M) 400 mmol/L was chosen as reference)(a);transformation coefficient to shift storage/loss modulus curves in different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL) (b); Time-pH superposition curves of rheology data for HA/CH complex coacervates (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL,curves in pH 5.5 was chosen as reference)(c);Shift factors to transform curves of rheology data for HA/CH complex coacervates (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL)(d)

圖5a、5c是通過縮放分析并引入合適的轉(zhuǎn)換系數(shù)所獲得不同鹽濃度和pH下的G邈和G′的雙對數(shù)圖，橫坐標為震蕩頻率，引入鹽濃度轉(zhuǎn)換系數(shù)fG,I(M)和pH轉(zhuǎn)換系數(shù)fG,pH后可以觀察到疊加曲線?？梢钥闯隹s放后所有的曲線形狀相似，且可以較好的疊加在一起。縮放曲線的適用性意味著鹽濃度和pH的變化在不改變基本機制的情況下影響結(jié)合強度。

用于創(chuàng)建主曲線的轉(zhuǎn)換系數(shù)顯示在圖5b、5 d。轉(zhuǎn)換系數(shù)fG,I(M)，fG,pH越接近1，意味著隨著鹽濃度和pH的變化影響越小，越大于1，HA/CH復合凝聚體的形成對于pH、鹽濃度的改變越敏感[17]。轉(zhuǎn)換系數(shù)的大小直觀反映出HA/CH復合凝聚體對環(huán)境因素的敏感程度。

pH的改變會影響聚合物的電離，從而影響聚合物之間的相互作用[16]。由圖5 d可以看出：pH在3.5-5.5之間越小時，HA/CH復合凝聚體表現(xiàn)出對于pH的變化越敏感。在高pH值下(接近于5.5)，聚陰離子HA和聚陽離子CH幾乎完全電離，此時聚離子帶電基團最多，電荷密度最大，極大增加了聚離子鏈之間的結(jié)合強度。

形成復合凝聚體是因為HA和CH上的相反電荷之間存在強烈的靜電相互作用，但這些鍵作用力比較弱，它們可以被打開和重組。帶相反電荷的聚離子鏈之間的離子鍵是暫時的，鹽的添加會影響所有離子鍵的鍵能[20-21]，這是由于鹽解離的陽離子和陰離子可以作為聚離子鏈的電荷補償，降低HA/CH的結(jié)合強度，且體系內(nèi)含水量會增加。由圖5b可以看出：鹽濃度越大，HA/CH復合凝聚體對鹽濃度越敏感?？傮w而言，pH和鹽濃度都影響CH和HA的結(jié)合，但不影響HA和CH的相互作用機制。

3 結(jié)論

(1)聚電解質(zhì)復合物凝聚體的形成受到鹽濃度和pH的強烈影響。

(2)pH在3.5～5.5變化時會影響聚離子的解離度，從而影響其帶電密度，帶電密度越高時，其聚離子的結(jié)合強度越強。

(3)鹽的添加會影響離子鍵的鍵能，鹽解離的陽離子和陰離子可作為聚離子鏈的電荷補償，且鹽的添加會降低HA/CH的結(jié)合強度。

(4)聚電解質(zhì)電荷密度和鹽離子的濃度均強烈影響聚電解質(zhì)結(jié)合的速率，但不影響聚電解質(zhì)復合凝聚時電荷之間鍵合基本機制。

(5)本文通過研究HA/CH復合凝聚體的流變性能來研究其內(nèi)部相互作用，這種方法對于其他復合凝聚體材料的研究具有很好的參考價值。