王振東，魯曉燕，涂文文，王曉麗，何晨晨

(1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 石河子832003)

新疆棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展突飛猛進(jìn)[1]，截至2016年底，新疆棗樹種植總面積504511公頃[2]。很多棗園土壤鹽堿性過強(qiáng)，土地鹽堿化嚴(yán)重影響著新疆棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。棗的耐鹽性取決于砧木，新疆栽培棗大多數(shù)都以酸棗(ZiziphusacidojujubaC.Y.Cheng et M.J.Liu)為砧木[4]，研究酸棗的耐鹽機(jī)制，對利用鹽堿地發(fā)展棗產(chǎn)業(yè)具有重要意義。植物激素在植物適應(yīng)變化環(huán)境的能力中起著中心作用[5]。在植物遭受逆境脅迫時(shí),植物激素被認(rèn)為是參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育和包括鹽脅迫在內(nèi)的各種脅迫的耐受或易感性的重要內(nèi)源因子[6-7]。植物內(nèi)源激素以協(xié)同調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及對逆境的適應(yīng)，植物組織中激素水平的變化被認(rèn)為是控制由于鹽度引起的生長減少的一個(gè)初始過程[8]。

Ca2+是一種信使分子，能介導(dǎo)植物對外界信號(hào)的刺激反應(yīng)，調(diào)節(jié)植物多種生理過程[9]；Ca2+對5種已知的植物激素的功能都有強(qiáng)烈的修飾效應(yīng)，Ca2+或者加強(qiáng)某些激索的生理效應(yīng)，或者抑制一些激素的效應(yīng)[10-12]，所以研究外源鈣處理下植物體內(nèi)內(nèi)源激素在鹽脅迫下動(dòng)態(tài)變化有重要意義。

為了進(jìn)一步探討CaCl2在酸棗適應(yīng)NaCl脅迫中的作用，本文在前期工作[13]基礎(chǔ)上研究CaCl2對 NaCl 脅迫下酸棗幼苗葉和根生長素(growth substance，IAA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、玉米素(zeatin，ZT)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其處理

試驗(yàn)于2018年3月到10月進(jìn)行，挑選大小一致的酸棗種子，用0.5% KMnO4消毒30 min后放入發(fā)芽盒，置于人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)中閉光催芽，待幼苗長出2片真葉后，選擇生長健壯、整齊一致的幼苗用2 cm厚的泡沫板懸浮于水培盒中置于人工氣候箱(光照強(qiáng)度12000 lx，光照時(shí)間14 h，黑暗時(shí)間10 h；相對濕度65%～70%；溫度25～28 ℃)。其中，水培盒大小為19 cm×13 cm×11 cm(長×寬×高)，每個(gè)水培盒加1倍日本園試配方營養(yǎng)液500 mL，每3 d更換一次營養(yǎng)液。

幼苗長到6片真葉完全展開時(shí)，開始以下4種處理：(1)Na處理(CK)：日本園試配方營養(yǎng)液 + 150 mmol/LNaCl；(2)Na+ 5Ca處理：日本園試配方營養(yǎng)液 + 150 mmol/L NaCl + 5 mmol/L CaCl2；(3)Na+ 10Ca處理：日本園試配方營養(yǎng)液+150 mmol/L NaCl + 10 mmol/L CaCl2；(4)Na+ 20Ca處理：日本園試配方營養(yǎng)液 + 150 mmol/L NaCl + 20 mmol/L CaCl2。每個(gè)處理重復(fù)6次，每個(gè)重復(fù)15株幼苗。為避免鹽激反應(yīng)，Na處理和Na+ Ca處理中，NaCl濃度以每天50 mmol/L的梯度逐步遞增，全部處理于同一天達(dá)到目標(biāo)濃度，此時(shí)設(shè)為第0 h，分別在0、6、12、24、48、96 h時(shí)采樣，每次選取15株苗，混合葉片(葉片要完全展開)和根系進(jìn)行隨機(jī)取樣，分6次全部取完。每個(gè)器官設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取樣后立即放入液氮中，放入超低溫冰箱(-80 ℃)中保存，待用于激素含量的測定。

1.2 HPLC 流動(dòng)相的選擇

高效液相色譜儀(LC-2010AHT，日本島津)，離心機(jī)(HITACHI，CR22GIE)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000 A)。ZT、GA3、IAA、ABA標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，乙酸乙酯、甲醇、乙酸為色譜級(jí)，鹽酸、磷酸氫二鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。使用0.45 um微孔濾膜過濾所有試劑使用。

HPLC條件如下：AgilentC18ZORBAX反向色譜柱(150 mm×46 mm，5 μm)；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；采用切換波長法以外標(biāo)法進(jìn)行定量測定；流動(dòng)相V(甲醇)∶V(超純水含1%乙酸)=48∶52。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配置

分別稱取0.005 g ZT、0.01 g IAA、0.125 g GA3和0.005 g ABA標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶，即為4種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為母液，逐級(jí)稀釋，配制成含有ZT、GA3、IAA和ABA的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用優(yōu)化的色譜條件，依次進(jìn)樣檢測，以激素質(zhì)量濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)，以峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)，建立4種激素的回歸方程。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程如下：用50 mL 100%甲醇溶解激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取25 mL上述 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入25 mL甲醇稀釋，依次吸取前一步標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入25 mL甲醇稀釋，依次稀釋3次，形成5個(gè)濃度，測出每個(gè)濃度的峰面積，從而計(jì)算出各個(gè)激素含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 測定指標(biāo)和方法

準(zhǔn)確稱取0.2 g冷藏的酸棗材料，加入10 mL預(yù)冷的80%甲醇和液氮研磨成勻漿，密封后置于4 ℃冰箱靜置不同時(shí)間；4 ℃條件下離心10 min后取上清液，殘?jiān)尤?0%甲醇離心重復(fù)3次合并上清液，將全部的上清液于40 ℃條件下旋蒸至原體積的三分之一, 將余下的提取液調(diào)至pH=8，加入30 mL的石油醚脫色3次，棄醚相，再加入0.1 g的PVPP震蕩后過濾；再調(diào)整濾液pH=3，加20 mL乙酸乙酯重復(fù)萃取4次合并酯相，在40 ℃條件下減壓蒸干，殘留物加2 mL的乙酸溶解3次后將溶解液過sep-pak18小柱純化，用甲醇洗脫后減壓蒸干，用80%甲醇溶解定容至2 mL溶液過0.22 μm的微孔濾膜后HPLC分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19進(jìn)行分析，多重比較采用Duncan，s新復(fù)極差法，用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，作圖軟件使用 Origin2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉、根IAA含量的影響

結(jié)果(圖1)顯示:

(1)與CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理各時(shí)間點(diǎn)酸棗幼苗葉和根中IAA含量均顯著高于CK；在48 h，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理酸棗幼苗葉中IAA含量分別是CK的1.45、1.37、1.25倍，酸棗幼苗根IAA含量分別是CK的1.56、1.56、1.15倍。

(2)與0 h相比，CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理酸棗幼苗葉和根中IAA含量隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢；在96 h，葉中IAA含量分別下降41.65%、39.04%、37.12%、41.85%，根中IAA含量分別下降49.47%、29.78%、43.64%、55.36%。

不同小寫字母表示同一時(shí)間不同濃度間的顯著水平(P<0.05，n=3)，不同大寫字母表示同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)的顯著水平(P<0.05，n=3)圖1 CaCl2處理對酸棗幼苗葉和根IAA含量的影響Fig.1 Effect of CaCl2 treatment on IAA content in leaves and roots of jujube jujube seedlings(Different lower-case letters indicate significant levels between different concentrations at the same time (P< 0.05, n=3), and different upper-case letters indicate significant levels at different time points at the same concentration (P< 0.05, n=3)

2.2 CaCl2對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉、根GA3含量的影響

結(jié)果(圖2)顯示:

(1)與CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理各時(shí)間點(diǎn)酸棗幼苗葉和根中GA3含量均顯著高于CK；在48 h，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理酸棗幼苗葉中GA3含量分別是CK的2.14、2.08、1.58倍，酸棗幼苗根中GA3含量分別是CK的2.44、2.26、1.42倍。

(2)與0 h相比，CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這4種處理酸棗幼苗葉和根中GA3含量都隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢；在96 h，葉中GA3含量分別下降83.12%、43.56%、49.42%、72.82%，根中GA3含量分別下降75.90%、42.95%、47.85%、68.31%。

圖2 CaCl2處理對酸棗幼苗葉和根GA3含量的影響Fig.2 Effect of CaCl2 treatment on the content of GA3 in leaves and roots of jujube jujube seedlings

2.3 CaCl2對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉、根ZT含量的影響

結(jié)果(圖3)顯示:

(1)與CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理6、12、24、48、96 h酸棗幼苗葉中ZT含量均顯著高于CK；酸棗幼苗根中ZT含量在12、24、48、96 h顯著低于對照；在48 h，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理酸棗幼苗葉中ZT含量分別是CK的1.11、1.12、1.04倍，酸棗幼苗根中ZT含量分別是CK的0.94、0.91、0.83倍。

(2)與0 h相比，在CK、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理酸棗幼苗葉和根中ZT含量都隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢；在96 h，葉中ZT含量分別下降了45.97%、24.46%、40.30%、43.05%，根中ZT含量分別下降了1.88%、34.18%、31.76%、38.31%。

圖3 CaCl2處理對酸棗幼苗葉和根ZT含量的影響Fig.3 Effect of CaCl2 treatment on ZT content in leaves and roots of jujube jujube seedlings

2.4 CaCl2對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉、根ABA含量的影響

結(jié)果(圖4)顯示:

(1)與對照相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理0、6、12、24、48 h酸棗幼苗葉和根中ABA含量均顯著低于CK；在48 h，酸棗幼苗葉中ABA含s量分別是CK的0.65、0.67、0.81倍，酸棗幼苗根中ABA含量分別是CK的0.60、0.65、0.88倍。

(2)與0 h相比, 在CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這4種處理下酸棗幼苗葉和根的ABA含量都隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢；在96 h，酸棗幼苗葉中ABA含量分別是0 h的1.70、1.65、3.87、2.41倍，根ABA含量分別是0 h的2.02、2.34、2.094、4.06倍。

圖4 CaCl2處理對酸棗幼苗葉和根ABA含量的影響Fig.4 Effects of CaCl2 on ABA concentrations in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.5 CaCl2對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉、根ZT/ABA比值的影響

結(jié)果(圖5)顯示:

(1)與CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca這2種處理各時(shí)間點(diǎn)酸棗幼苗葉中ZT/ABA 比值均顯著高于CK，Na+20Ca處理12、24、48、96 h酸棗幼苗葉中ZT/ABA 比值與CK無顯著差異；Na+5Ca、Na+10Ca這2種處理0、6、12、48、96 h酸棗幼苗根中ZT/ABA 比值顯著高于CK；Na+20Ca處理0、6、12 h酸棗幼苗根中ZT/ABA 比值顯著高于CK，在24、48、96 h根中ZT/ABA 比值與CK無顯著差異。

(2)與0 h相比, CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+ 20Ca這4種處理酸棗幼苗葉和根ZT/ABA的比值都隨處理時(shí)間的延長呈顯著降低趨勢；在96 h，酸棗幼苗葉中ZT/ABA 比值分別下降了67.87%、54.10%、84.65%、76.94%，根中ZT/ABA 比值分別下降了51.70%、71.94%、67.49%、84.88%。

圖5 CaCl2處理對酸棗幼苗葉和根ZT/ABA的比值的影響Fig.5 Effect of CaCl2 treatment on ZT/ABA ratio of leaves and roots of jujube jujube seedlings

2.6 CaCl2對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉、根IAA/ABA比值的影響

結(jié)果(圖6)顯示:

(1)與對照相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理各時(shí)間點(diǎn)酸棗幼苗葉中IAA/ABA 比值均顯著高于CK；Na+5Ca和Na+10Ca這2種處理各時(shí)間點(diǎn)酸棗幼苗根中IAA/ABA 比值均顯著高于CK；Na+20Ca處理0、6、12、24 h酸棗幼苗根中IAA/ABA 比值顯著高于CK，在48、96 h根中IAA/ABA的比值與CK無顯著差異。

(2)與0 h相比, CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這4種處理酸棗幼苗葉和根IAA/ABA的比值都隨時(shí)間延長呈顯著降低趨勢；在96 h，酸棗幼苗葉中IAA/ABA 比值分別下降了65.21%、69.93%、83.84%、75.90%，根中IAA/ABA 比值分別下降了75.26%、69.93%、73.14%、75.90%。

2.7 CaCl2對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉、根GA3/ABA比值的影響

結(jié)果(圖7)顯示:

(1)與對照相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這3種處理各時(shí)間點(diǎn)酸棗幼苗葉中GA3/ABA的比值均顯著高于CK；Na+5Ca和Na+10Ca這2種處理在各時(shí)間點(diǎn)酸棗幼苗根中GA3/ABA 比值均顯著高于CK；Na+20Ca處理0、6、12、24 h酸棗幼苗根中GA3/ABA 比值顯著高于CK，在48、96 h根中GA3/ABA 比值與CK無顯著差異。

(2)與0 h相比, CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca這4種處理酸棗幼苗葉和根中GA3/ABA 比值都隨處理時(shí)間延長呈顯著降低趨勢；在96 h，葉中GA3/ABA比值分別下降了88.09%、75.60%、75.09%、92.45%，根GA3/ABA比值分別下降了89.96%、65.69%、86.93%、88.72%。

圖7 CaCl2處理對酸棗幼苗葉和根GA3/ABA的比值的影響Fig.7 Effect of CaCl2 treatment on the ratio of GA3/ABA between leaves and roots of jujube jujube seedlings

3 討論

(1)ABA作為一種脅迫激素,在干旱和鹽脅迫中的作用至少有兩個(gè)方面：水平衡和細(xì)胞脫水耐受性,并在調(diào)節(jié)植物的氣孔行為和氣體交換中起著重要作用[14-15]。前人研究已表明，鹽和干旱會(huì)引起的植物ABA含量增加[16]；郭秀林等發(fā)現(xiàn)不同鈣離子螯合劑、EGTA、Vp等處理皆能促進(jìn)根和葉片ABA含量的提高[17]，而添加外源Ca(N03)2的可以降低ABA水平[18]；本文研究表明，Na+10Ca、Na+10Ca處理酸棗ABA含量顯著低于對照，而Na+20Ca處理在NaCl脅迫隨著下時(shí)間的延長ABA含量大幅增加，但是由于其ABA累積的量比對照少，仍然減輕了酸棗的鹽害；3種不同濃度CaCl2處理降低了酸棗幼苗葉和根中ABA的含量，減少了ABA對生長的抑制作用，緩解了鹽脅迫的毒害作用，從而減輕了鹽害。

(2)ABA還與其它植物激素一起調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育，ZT、GA3、IAA等在植物遭受逆境脅迫時(shí)也起重要作用。細(xì)胞分裂素主要在根系中產(chǎn)生，鹽脅迫下根中細(xì)胞分裂素合成量減少，進(jìn)而使植物其它器官細(xì)胞分裂素含量降低[19]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度CaCl2處理下葉中ZT含量高于對照，而根中則相反，可能是外源CaCl2處理可以使酸棗幼苗在NaCl脅迫下使根部合成的ZT快速向葉中轉(zhuǎn)移，從而更好的協(xié)調(diào)激素間的平衡，有利于酸棗幼苗在鹽害中生存。

水分脅迫下甘薯植株體內(nèi) IAA、GA3和 ZR 等激素含量降低，而ABA含量增加[20]；楊樹在NaCl脅迫下，隨著NaCI脅迫濃度的增加，IAA/ABA、GA3/ABA比值越低, 受鹽脅迫程度越大[21]；本文研究表明，在150 mmol/L NaCl脅迫下，酸棗幼苗通過降低葉和根中IAA/ABA、GA3/ABA和ZT/ABA比值的方式來調(diào)節(jié)自身的激素平衡以此來適應(yīng)外界NaCl脅迫環(huán)境；5、10 mmol/L10 CaCl2處理酸棗幼苗葉和根IAA/ABA、GA3/ABA和ZT/ABA比值顯著高于對照，這進(jìn)一步說明外源CaCl2處理下NaCl脅迫酸棗幼苗可以調(diào)節(jié)自身的激素平衡以適應(yīng)外界鹽脅迫的能力強(qiáng)于對照，其幼苗受NaCI脅迫抑制作用較小。

(3)Ca2+作為第二信使，參與了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在逆境生理方面都起著重要的作用[9,12]。鹽脅迫會(huì)破壞質(zhì)膜的完整性，抑制Ca2+的吸收和利用[22]。補(bǔ)充適量的外源Ca2+對于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和提高植物對鹽度的抵抗力是極為重要的[23-25]。草莓在鹽脅迫下，在缺鈣及鈣調(diào)素抑制劑TFP處理中，草莓內(nèi)源激素含量的變化趨勢與加鈣處理相反，證明ABA及其它激素含量在鹽脅迫條件下的變化受鈣信號(hào)調(diào)節(jié)[18]。

本研究顯示，CaCl2處理對酸棗在NaCl脅迫情況下均有一定的緩解作用，有效抑制了ABA含量的增加，提高了CTK、GA、IAA的水平；3種濃度CaCl2處理下酸棗體內(nèi)激素水平表現(xiàn)出差異，Na+5Ca處理緩解效果最好，Na+10Ca其次，Na+20Ca緩解效果最差，隨著CaCl2濃度的升高，其緩解效果反而下降，而且隨著處理時(shí)間的延長，高濃度鈣處理葉片和根系中內(nèi)源激素ZT(根除外)、GA3、IAA水平下降幅度接近對照，原因可能是鹽脅迫會(huì)對酸棗的細(xì)胞造成損害, 酸棗所需要的Ca2+減少,所以使用適量的外源鈣可以增強(qiáng)酸棗的抗鹽能力，過量的外源Ca2+可能會(huì)導(dǎo)致離子脅迫，加重酸棗受到的鹽害。

4 結(jié)論

在NaCl脅迫下，適當(dāng)濃度的CaCl2(5～10 mmol/L)能抑制酸棗幼苗葉和根ABA的增加，并使GA3、IAA和ZT含量和ZT/ABA、IAA/ABA、GA3/ABA的比值增加。