周紹酉 周寧 張魁 李揚 趙洋 宋邦榮 鄭居兵 劉濤帥 董然

冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass graft，CABG)后靜脈橋血管再狹窄嚴重影響冠心病患者預后，目前尚無有效治療手段[1]?；罨D錄因子3(activating transcription factor 3，ATF3)是參與靜脈橋血管再狹窄的一個重要因子，在血管炎癥反應中起重要作用[2]。CRISPR/Cas9是一種能夠對任何物種基因組的特定位點進行精確編輯的技術。使用該技術能夠進行細胞水平單基因或多基因敲除。其原理是核酸內切酶 Cas9蛋白通過向導RNA(guide RNA，gRNA)識別特定基因組位點并對雙鏈DNA進行切割[3]。本研究通過構建靶向ATF3基因Cas9編輯下慢病毒載體，并轉染人微血管內皮細胞(human microvascular endothelial cell， HMEC)后觀察其對ATF3基因表達的抑制作用。

材料與方法

1.一般材料 HMEC，293T cells，U6-sgRNAEF1a-Cas9-FLAG-P2A-EGFP載體(上海吉凱基因化學技術有限公司)，Oligo引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，限制性內切酶BsmBI(Thermo公司)，T4 DNA連接酶(Thermo公司)，TaqPlusDNA polymerase(Vazyme 公司)，移液器(1 000 μL，200 μL，Gilson。 100 mL，BIOHIT)、CO2 培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、生物安全柜、-80℃低溫冰箱、普通冰箱、溫度計(0-100℃)、離心機、液氮罐、BCA Protein Assay Kit、RIPA 裂解液、Prestained protein marker、NP-40裂解液、醫(yī)用X射線光片、X線膠片顯影粉、ECLPLUS/Kit。

2.方法 (1)ATF3基因 sgRNA處理：根據(jù)GeneBank提供的ATF3基因cDNA編碼序列NM_001674為模板，參照sgRNA原則設計，使用BLAST進行同源性分析，設計三條sgRNA靶點序列(GGTGTCCATCACAAAAGCCG， TGTCAGCGACAGACCCCTCG，AAAGTGCCGAAACAAGAAGA)，同時設計一條無意義對照sgRNA序列(CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA)，上游引物 5′-CACCG-3′，下游引物 5′-GTTT-3′，把引物干粉溶解于退火緩沖液中，95℃水浴15 min，然后自然冷卻至室溫，將退火產物稀釋200倍后使用，上下游引物中此時引入限制性內切酶BsmBI結合位點，帶有內切酶黏性末端的向導RNA備置完成。PCR反應條件：95℃水浴15 min，然后自然冷卻至室溫，將退火產物稀釋200倍后備用。

(2)ATF3基因Cas9慢病毒載體構建：根據(jù)3條連接限制性內切酶黏性末端的向導RNA以及一條無意義序列，分別設計合成雙鏈oligoDNA，與限制性內切酶BsmBI雙酶切載體U6-EF1a-Cas9-FLAGP2A-EGFP 進行連接，PCR 鑒定，98℃，5min，1個循環(huán)。 98 ℃，10 s，55 ℃，10 s，72 ℃，90 s，30 個循環(huán)。72℃，8min，1個循環(huán)。4℃保存。退火溫度依據(jù)引物或基因GC含量而定，退火溫度一般設定比引物的溫度低5℃。挑選重組陽性克隆，進行測序鑒定。連入sgRNA片段的陽性克隆得到大小為343 bp的條帶。

(3)慢病毒包裝：轉染前用胰蛋白酶消化293T細胞。調整細胞密度為5×106/15 mL，重新接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24 h待細胞密度達70%～80%時用于轉染。2 h后更換為無血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備的 DNA 溶液(GV 393質粒 20 μg、pHelper1.0載體質粒 15 μg、pHelper2.0 載體質粒 10 μg)，調整總體積為1 ml，在室溫下溫育15 min?；旌弦壕徛渭又?93T細胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后棄去含有轉染混和物的培養(yǎng)基，加入10 ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養(yǎng)皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄。緩慢加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基20 ml，于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。根據(jù)細胞狀態(tài)，收集轉染后48 h(轉染即可為0 h計起)的293T細胞上清液。濃縮病毒并分裝保存。

(4)慢病毒滴度測定：測定前一天，使用293T貼壁細胞鋪板，96孔板，每孔4×104個細胞，體積100 μL。根據(jù)病毒的預期滴度，準備7～10個無菌的EP管，每管中加入90 μL的無血清培養(yǎng)基。取待測定的病毒原液10 μL加入到第一個管中，混勻后，取10 μL加入到第二個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管。選取所需的細胞孔，棄去90 μL培養(yǎng)基，加入90 μL稀釋好的病毒溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4 h后，加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 d后，觀察熒光表達情況，熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。

(5)慢病毒轉染HMEC：使用感染液將細胞制成3～5×105/mL懸液，接種相應的細胞數(shù)到培養(yǎng)板中。鋪板后參照預實驗確定的MOI加入最適病毒量感染。8～12 h將各孔中細胞收集到干凈的1.5 mL EP管中，以2 000 r/min離心2 min，去掉上清液，更換為完全培養(yǎng)基，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。

(6)Western blot檢測ATF3抑制率：取細胞樣品，PBS洗滌兩次后，適量預冷的Lysis Buffer裂解，將細胞刮刮下細胞轉移入EP管中，冰上裂解10～15 min后超聲破碎細胞(200 W共4次，每次5 s，間隔2 s)。 4℃、12 000 min，離心15 min，取上清BCA法測定蛋白濃度，調整每個樣品蛋白濃度為2μg/μL，-80℃保存?zhèn)溆?。根?jù) ATF3分子量大小(23kDa)配制相應濃度的膠，膠凝固后，拔去梳子，電泳緩沖液清洗上樣孔，將準備好的樣品上樣。濃縮膠80 mA，20 min。分離膠120 mA，1h。電泳結束后，使用轉移電泳裝置，在4℃、300 mA恒流條件下電轉150 min，將蛋白轉移到PVDF膜上。用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1 h或4℃過夜。封閉液稀釋抗體，然后不封閉好的PVDF膜室溫孵育2 h，并用TBST洗膜4次，每次8 min。用封閉液稀釋相應的二抗，室溫下孵育PVDF膜1.5 h，并用TBST洗膜4次，每次8 min。PVDF膜置于平鋪好的保鮮膜上，以1：40的比例混合A液和B液，混合液均勻滴加在PVDF膜上，避光反應5 min。將膜取出，稍微瀝干多余的ECL底物反應液，放入暗盒，鋪上保鮮膜(避免產生氣泡)，放上X光片(避免 X光片的移動)，關上暗盒，曝光1～2 min。取出X光片，放入顯影液中，約1 min后取出，在清水中漂洗幾秒鐘，后放入定影液中2 min。取出X光片，晾干，分析。

3.統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.ATF3在Cas9干擾下載體構建 (1)基因信息見表1。

表1 基因信息與基因ID

(2)sgRNA序列見表2。

表2 向導RNA信息

(3)目的慢病毒載體：：載體名稱：GV393，元件順序：U6-sgRNA-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-EGFP，對照編號：CON251，對照插入序列：CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA(圖1)。

圖1 目的病毒載體示意圖 注：BsmBI為限制性核酸內切酶，由sgRNA引導內切靶點

(4)合成oligo信息：PCR陽性克隆進行DNA測序，結果與設計序列一致，Cas9載體構建成功 (表 3)。

表3 合成核苷酸鏈信息

2.病毒包裝及滴度測定 轉染96 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光表達，表達GFP的293T細胞數(shù)隨病毒稀釋倍數(shù)增加而減少(圖2～4，表4)。

表4 三組oligo病毒濃度測定

圖2 LV-ATF3-sgRNA(05125-1)細胞免疫熒光照片 注：b和g分別表示明視野和熒光視野

圖3 LV-ATF3-sgRNA(05126-1)細胞免疫熒光照片 注：b和g分別表示明視野和熒光視野

圖4 LV-ATF3-sgRNA(05127-1)細胞免疫熒光照片 注：b和g分別表示明視野和熒光視野

3.慢病毒轉染HMEC 倒置熒光顯微鏡熒光視野和明視野進行對比，感染可達到80%轉染率，在KO1、KO2、KO3組細胞感染及生長狀態(tài)良好，GFP可持續(xù)穩(wěn)定表達。細胞感染及生長狀態(tài)良好，GFP可持續(xù)穩(wěn)定表達。如圖5所示。

4.錯配酶切檢測 本實驗陽參的擴增片段大小為456 bp，酶切片段大小分別為 151 bp、303 bp，用來作為實驗對比，驗證實驗操作結果準確性，本實驗錯配酶中，陽參酶切結果正常。酶切反應體系為：純化產物 2～3 μL，Detecase Buffer2μL，加入 ddH2O 10 μL。在45℃反應20 min后立即向上述10 μL體系內加入2 μL Stop Buffer。Cas9-ATF3基因片段下方雜帶通過升高退火溫度來降低。

如圖6所示，PCR檢測到目的大小條帶。KO1、KO2、KO3靶點均有活性。將活性檢測中有效的靶點的PCR產物切膠回收后構建T載體，藍白斑篩選，每個靶點測30個單克隆進行測序，運用軟件對測序結果進行分析，對比靶點的有效突變率。測序結果分析：本實驗中PCA05125靶點，共測通30個克隆，5個插入缺失突變，3個無插入缺失突變，4個插入突變，10個缺失突變，6個大片段缺失突變，2個雙峰，可以得出該靶點的突變率達到80%以上。Cas9對ATF3基因突變有效。

根據(jù)酶切片段，三個靶點均有正常切割條帶，根據(jù)灰度分析情況，如圖7，KO3組細胞錯配酶差異性最大，堿基突變率明顯，因此本實驗選擇 KO3(PCA05127)做慢病毒載體鑒定試驗。

圖5 慢病毒轉染細胞 注：b和g分別表示明視野和熒光視野

圖6 混合克隆錯配酶篩靶 注：左側為酶切前，右側為酶切后。PC：陽性條帶對照。M：Ladder Marker(條帶從小到大分別為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp， 2 000 bp， 3 000 bp， 5 000 bp)。 KO1、KO2、KO3：實驗組對應的3個靶點。NC：各實驗組對應的陰性對照

圖7 錯配酶灰度分析 注：KO1、KO2、KO3：實驗組對應的3個靶點。PC：陽性條帶對照。M：Ladder Marker(條帶從小到大分別；100 bp， 250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，15 00 bp， 2 000 bp， 3 000 bp， 5 000 bp)。 KO1、KO2、KO3：實驗組對應的3個靶點。NC：各實驗組對應的陰性對照

5.Western blot檢測ATF3抑制率 其引物信息如下：內參基因 GAPDH，其上游引物序列為TGACTTCAACAGCGACACCCA，下游引物序列為CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA，擴增片段大小為121 bp。目的基因為ATF3，其上游引物序列為GCTAAGCAGTCGTGGTATG，下游引物序列為CTGGAGTTGAGGCAAAGAT，擴增片段大小為225 bp(圖8)。

圖8 Western blot篩選有效靶點電泳圖 MOCK：空細胞。NC：陰性對照病毒感染組。KO：sgRNA病毒感染組。H：高曝光，L：低曝光，目的細胞為人微血管內皮細胞，GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

在陽參細胞中檢測到目的條帶，大小與預期相符，表明此次WB實驗體系工作正常。在目的細胞HMEC中檢測到目的條帶，KO組相對NC明顯下調。即sgRNA對ATF3基因的編輯在蛋白水平觀察到表達量的改變。ATF3基因在Cas9干擾下簡表達載體構建成功(圖9)。

圖9 Western blot灰度分析圖MOCK：空細胞。NC：陰性對照病毒感染組。KO：sgRNA病毒感染組

討 論

CABG是治療重癥冠心病的有效方法，大隱靜脈是常用靜脈橋血管，但靜脈橋血管遠期通暢率低于乳內動脈，靜脈橋血管再狹窄影響患者術后生存質量[4]。研究結果表明，內皮功能失調是CABG術后靜脈橋血管再狹窄的始動環(huán)節(jié)。術后靜脈橋血流壓力突然增高，血管過度擴張引起管壁損傷，導致內皮結構及功能變化，內皮細胞增生，PCT和WBC迅速黏附，加速急性血栓形成，導致內膜增生[5]。同時，炎性細胞與內皮細胞黏附后進入內皮，在細胞因子和生長因子影響下，移行為巨噬細胞，吞噬脂質后轉化為泡沫細胞，引進粥樣斑塊形成，中膜平滑肌細胞增殖并向內層遷移，多種因素共同作用，最終導致橋血管再狹窄[6]。

CRISPR/Cas9是一種能夠對任何物種基因組的特定位點進行精確編輯的技術。使用該技術能夠進行細胞水平單基因或多基因敲除。其機制是核酸內切酶Cas9蛋白通過向導RNA識別特定基因組位點并對雙鏈 DNA進行切割。相較于 RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術來講，更加精確特異性下調細胞目的基因的表達。

轉錄激活因子3是ATF/CREB轉錄因子家族的成員，ATF/CREB家族包括一系列分子，它們的共同特點是都具有亮氨酸拉鏈結構，通過與cAMP反應元件的啟動子共同序列“TGACGTCA”相結合來調控基因的轉錄[7]。大量的證據(jù)表明，在正常條件下穩(wěn)定表達，但是在應激條件下ATF3的mRNA的表達水平大大增加(如：活性氧，紫外刺激，心肌缺氧，藥物影響等)。在動物模型中，在心肌缺血和心肌缺血再灌注，肝缺血，肝部分切除，化學物質如乙醇、四氯化碳、對乙酰氨基酚作用，癲癇發(fā)作，在腎臟的腎缺血再灌注損傷，皮膚受創(chuàng)，外周神經損傷，激活胸腺細胞CD31誘導ATF3[8]。在培養(yǎng)的細胞，ATF3是由多種信號誘導的，包括細胞活素類，遺傳毒物如紫外線和電離輻射和已知誘導細胞死亡的藥物或JNK/SAPK信號轉導通路，如茴香霉素，環(huán)己酰胺、阿霉素。由此表明ATF3是一個應激誘導性基因[9]。

本研究中，通過構建慢病毒載體，并包裝獲得有感染能力的慢病毒顆粒，成功轉染HMEC，轉染率＞80%。正常狀態(tài)下ATF3低表達或不表達，驗證3個不同序列的抑制效果，避免了低表達基因的檢測困難，并尋找到一條既高效、且確切穩(wěn)定阻斷ATF3表達的序列(LV-ATF3-sgRNA(05127-1)。

Cas9編輯慢病毒與一般載體相比，慢病毒載體可感染分裂期與非分裂期細胞，其整合到基因組中可實現(xiàn)長時間穩(wěn)定表達，且滴度較反轉錄病毒體系更好。同時，慢病毒屬缺陷病毒，不會對細胞的連續(xù)傳代產生不良影響。從免疫印跡檢測該載體構建結果來看，在目的細胞載體細胞中檢測到目的條帶，KO組相對NC明顯下調(P＜0.05)。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，ATF3在心血管系統(tǒng)的含量與各種心血管疾病相關，如缺血再灌注損傷，心肌肥厚，心力衰竭和血管系統(tǒng)疾病等[10]。本研究成功構建了靶向ATF3基因敲除慢病毒載體，成功找到一個高效 抑制ATF3表達的質粒。為進一步研究ATF3在靜脈橋血管再狹窄中早期內皮功能失調作用機制奠定了基礎，并為探索橋血管再狹窄基因治療提供實驗依據(jù)。