康寶玲 ，李明花 ，秦文杰 ，裴妙榮 ，楊曉寧 ，梁娟娟 ，李 坤

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.北京振東光明藥物研究院，北京100085； 3.山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原030012）

銀屑舒凝膠是由山西振東制藥股份有限公司研制的中藥六類新藥，由土大黃、苦參等藥味組成，具有清熱解毒、燥濕止癢之功效，用于治療尋常型銀屑病。方中土大黃為蓼科酸模屬植物皺葉酸模（Rumex crispus L.）巴天酸模（Rumex patientia L.）的干燥根及根莖，常在民間使用［1］，具有止血、殺蟲、清熱解毒和消腫的功能。文獻(xiàn)研究表明，土大黃的主要成分有蒽醌、萘及萘醌、黃酮類及鞣質(zhì)類等［2］，其中大黃素有明顯的體外抗菌活性［3］，巴天酸模根的乙醇提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，這均是其治療銀屑病的可能作用機(jī)制［4］。張燕等［5］在探索土大黃提取物治療銀屑病作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)其主要藥效成分可能為蒽醌類成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蒽醌類成分對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有抑制作用，是治療銀屑病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一［6］。

在中藥新藥研究過程中，從藥材到提取物中間體再到成藥制劑，影響因素眾多且環(huán)節(jié)復(fù)雜，因此，明確制備過程中的活性成分轉(zhuǎn)移以及含量限定指標(biāo)是中成藥標(biāo)準(zhǔn)化體系建立的關(guān)鍵步驟。銀屑舒凝膠作為企業(yè)自主研發(fā)的新藥，其質(zhì)量控制是前期藥學(xué)研究的重要基礎(chǔ)性工作，基于此，本文選取了蒽醌類成分中的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚作為指標(biāo)性成分，建立了同時(shí)測(cè)定銀屑舒凝膠中間體中三種有效成分含量的高效液相色譜法，并對(duì)3批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了檢驗(yàn)過程的快速、穩(wěn)定及可控。本研究為銀屑舒凝膠生產(chǎn)全過程的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)體系的建立提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站；ME204分析天平（METTLE TOLEDO）；水浴鍋：HH-6D1常州美特儀器制造有限公司，數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE型）：昆山市超聲儀器有限公司；Drict-Q5超純水機(jī)。

1.2 材料

大黃素（批號(hào)：110756-200110）大黃酚（批號(hào)：110796-201379），大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201013）以上對(duì)照品均購(gòu)自中檢所。處方中土大黃采挖于北京延慶和山西平順，并經(jīng)郭寶林研究員鑒定為巴天酸模，符合《北京市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1998年版“土大黃”項(xiàng)下規(guī)定；苦參來自于山西振東道地藥材公司，符合2015年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)下規(guī)定；甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克；水為超純水；其余所用化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

phenomenex Luna C18（5 μm，4.6×250 mm），流動(dòng)相為甲醇（81%）-0.1%磷酸水（19%），檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱定大黃素對(duì)照品10.22 mg，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得大黃素儲(chǔ)備液（0.102 2 mg/mL）；精密稱定大黃酚對(duì)照品12.45 mg，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得大黃酚儲(chǔ)備液（0.124 5 mg/mL）；精密稱定大黃素甲醚對(duì)照品11.84 mg，加適量二氯甲烷溶解，并用甲醇稀釋至刻度，制得大黃素甲醚儲(chǔ)備液（0.118 4 mg/mL），3個(gè)儲(chǔ)備液均至4℃冰箱儲(chǔ)存。

2.3 供試品的制備

2.3.1 提取方式的考察［7］取中間體0.2 g，精密稱定4份，置錐形瓶中，精密加入2.5 mol/L的硫酸20 mL、氯仿25 mL，稱定質(zhì)量，1、2#超聲處理（功率 200 W，頻率 40 kHz）1 h，3、4#加熱回流（80 ℃）1 h，放冷，補(bǔ)重，精密量取氯仿液10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL，即得供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表1。用水浴回流提取所測(cè)得干膏粉中總蒽醌的含量稍高于超聲提取所得的含量（回流比超聲所得總蒽醌的含量高4.24%），且平行性均較好，因此選擇回流方式進(jìn)行提取。

表1 不同提取方法所得總蒽醌含量的比較

2.3.2 酸種類的考察 依照參考文獻(xiàn)［8］分別選用2.5 mol/L的硫酸、8%的鹽酸、冰醋酸-25%鹽酸（9∶1），取中間體0.2 g，精密稱定6份，置錐形瓶中，1、2#精密加入2.5 mol/L的硫酸20 mL，3、4#加入8%的鹽酸 20 mL，5、6# 加入冰醋酸-25%鹽酸（9∶1）20 mL，同“2.3.1項(xiàng)”下回流方式制得供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。2.5 mol/L的硫酸水解蒽醌所得含量最高為8.188 mg/g，相比8%鹽酸水解蒽醌所得的含量高64.09%，比冰醋酸：25%鹽酸（9∶1）水解蒽醌得的含量高58.18%，因此選擇2.5 mol/L的硫酸水解蒽醌。

表2 不同酸種類水解所得蒽醌含量的比較

2.3.3 酸用量的考察［9］取中間體0.2 g，精密稱定6份，置錐形瓶中，加入氯仿25 mL，分別精密加入 2.5 mol/L 硫酸 10、20、30 mL，稱定重量，同“2.3.1項(xiàng)”下回流方式制得供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表3，當(dāng)酸用量隨之增大時(shí)，水解得到的蒽醌的含量無明顯變化，3個(gè)不同用量下的蒽醌含量的RSD值為0.86%，因此為了節(jié)省溶劑，最終選擇10 mL的硫酸水解蒽醌。

表3 不同酸用量比較 （n=2）

2.3.4 萃取量的考察 取中間體0.2 g，精密稱定6份，置錐形瓶中，加2.5 mol/L的硫酸10 mL，分別精密加入氯仿 15、25、30 mL，稱定重量，同“2.3.1項(xiàng)”下回流方式制得供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表4，15 mL、25 mL、35 mL的氯仿量對(duì)蒽醌含量的影響不大，其RSD為0.85%，因此選擇15 mL的氯仿用量進(jìn)行萃取。

表4 不同萃取量比較

2.3.5 提取時(shí)間的考察 取中間體0.2 g，精密稱定6份，置錐形瓶中，精密加入15 mL氯仿，2.5 mol/L硫酸10 mL，同“2.3.1項(xiàng)”下回流方式制得供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定，其中1、2#回流 60 min，3、4# 回流 90 min，5、6# 回流 120 min，結(jié)果見表5，提取60、90、120 min蒽醌含量無明顯變化，其RSD為1.38%，可認(rèn)為60 min已經(jīng)將蒽醌類成分幾乎提取完全，為節(jié)約時(shí)間，故選擇最佳的提取時(shí)間為60 min。

表5 不同提取時(shí)間比較

2.3.6 萃取次數(shù)的考察 取中間體0.2 g，精密稱定2份，置錐形瓶中，精密加入15 mL氯仿、2.5 mol/L硫酸10 mL，稱定重量，水浴回流1 h，放冷，補(bǔ)重，搖勻，精密量取氯仿液10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，取續(xù)濾液1 mL，得供試品溶液 1、2；同法操作兩次，得供試品 3、4、5、6，按2.1項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果見表6，當(dāng)萃取兩次后蒽醌含量達(dá)到99.59%左右，在誤差允許的范圍內(nèi)可認(rèn)為已經(jīng)將蒽醌萃取完全，故綜合考慮選擇萃取兩次。

表6 不同萃取次數(shù)比較

2.3.7 供試品溶液制備的最優(yōu)工藝 取中間體0.2 g置錐形瓶中，精密稱定，加2.5 mol/L的硫酸溶液10 mL、氯仿15 mL，稱定重量，加熱回流（80℃）1 h，放冷，補(bǔ)重，精密量取氯仿液10 mL于蒸發(fā)皿中，同法操作兩次，合并兩次萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，搖勻取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.2項(xiàng)”下的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋制得質(zhì)量濃度分別為5.11、10.22、25.55、51.1、102.2 μg/mL的大黃素對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為 6.22、12.45、24.9、62.25、124.5 μg/mL 的大黃酚對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為5.92、11.84、23.68、59.2、118.4 μg/mL 的大黃素甲醚對(duì)照品溶液。按“2.1項(xiàng)”下的測(cè)定，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見表7，式中X代表濃度，Y代表峰面積。

表7 3個(gè)成分的線性回歸方程

2.4.2 專屬性考察 按處方比例及工藝路線制成缺土大黃的陰性中間體，再按照“2.3.7項(xiàng)”下方法制得陰性供試品樣品，按“2.1項(xiàng)”下測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性供試品樣品溶液色譜圖在大黃素、大黃酚和大黃素甲醚處無吸收，說明陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖1。

2.4.3 重復(fù)性考察 取同一批中間體0.2 g，精密稱定6份，按“2.3.7項(xiàng)”下平行制備供試品溶液，在“2.1項(xiàng)”下測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果表明大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為3.332、3.343、0.973 mg/g，RSD為1.21%、0.73%、1.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 蒽醌含量測(cè)定專屬性考察HPLC圖

2.4.4 中間精密度考察 讓實(shí)驗(yàn)室兩名實(shí)驗(yàn)員按“2.3.7項(xiàng)”下平行制備供試品溶液6份，在“2.1項(xiàng)”下進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果不同實(shí)驗(yàn)員用不同的儀器測(cè)得的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量的RSD分別為1.17%、0.83%、2.42%，可認(rèn)為該樣品制備方法的中間精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下分別在 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為0.49%、0.46%、0.40%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定中間體0.1 g，分別按表8要求加入對(duì)照品溶液，按“2.3.7項(xiàng)”下方法制備，在“2.1項(xiàng)”下測(cè)定并計(jì)算。結(jié)果見表8。

表8 三個(gè)蒽醌類成分的加樣回收率試驗(yàn)

2.5 樣品含量測(cè)定

分別取3批樣品，按照“2.3.7項(xiàng)”下方法制備，在“2.1項(xiàng)”下測(cè)定，結(jié)果中間體中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量分別為3.575、3.531、1.039 8 mg/g。

3 討論

在試驗(yàn)中分別考察不同流速（0.9 mL/min，1.0 mL/min，1.1 mL/min）、不同波長(zhǎng)（250 nm，254 nm，258 nm）、不同溫度（20℃，25℃，30℃）、不同流動(dòng)相比例［甲醇-0.1%磷酸水=（79∶21，81∶19，83∶17）、及不同廠家的 C18色譜柱（Phenomenex，Agilent，Waters bridge］。結(jié)果隨著增大流速或流動(dòng)相比例時(shí)，3個(gè)成分的出峰時(shí)間相對(duì)早，但分離度均＞6.0，對(duì)稱因子在1.01～1.08，均符合要求；當(dāng)改變柱溫和波長(zhǎng)時(shí)，其出峰時(shí)間、分離度、對(duì)稱因子均沒有變化，且含量的RSD分別為0.97%和0.45%；不同色譜柱考察結(jié)果表明蒽醌的分離對(duì)色譜柱的選擇性不強(qiáng)，3個(gè)色譜柱均可以使蒽醌的峰離開，且分離度、校正因子均符合要求，所測(cè)得的含量的RSD為1.10%，故該檢測(cè)方法的耐用性良好。

本文中所建立的高效液相色譜條件過程簡(jiǎn)單、快速，方法學(xué)考察符合要求，穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于銀屑舒凝膠中間體中指標(biāo)性成分的測(cè)定，為中間體及成型凝膠制劑的質(zhì)量控制提供切實(shí)可行的檢測(cè)方法，為后續(xù)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了數(shù)據(jù)支撐。