陳金玉，李 彬，何麗麗，梁?jiǎn)締?，韋英霞，韓業(yè)勤，張坤生*

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

冷凍貯藏是原料肉和肉制品保鮮貯藏的主要方式。在低溫條件下微生物和酶活性受到抑制，但是肌肉品質(zhì)的劣變?nèi)匀粺o(wú)法避免。尤其目前我國(guó)冷鏈技術(shù)尚不完善，在肉品的長(zhǎng)途運(yùn)輸、貯藏及消費(fèi)過(guò)程中，由于溫度波動(dòng)不可避免地出現(xiàn)反復(fù)凍融現(xiàn)象。肉在反復(fù)凍融過(guò)程中會(huì)發(fā)生肉質(zhì)硬化、柔軟性下降、持水力降低、組織纖維化等變化，產(chǎn)生這些現(xiàn)象的根本原因是肌原纖維蛋白的變性[1]。肌原纖維蛋白是由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白、輔肌動(dòng)蛋白等所組成的鹽溶性蛋白。反復(fù)凍融使樣品中小冰晶體重結(jié)晶，從而在肌原纖維中重新分布，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，肌原纖維蛋白變性，降低肉產(chǎn)品的食用價(jià)值[2]。因此研究反復(fù)凍融對(duì)肌肉品質(zhì)的影響以及控制肉蛋白冷凍變性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

冷凍變性保護(hù)劑又稱(chēng)抗凍劑，是目前防止蛋白冷凍變性的最主要方法。保護(hù)劑的種類(lèi)很多，蔗糖因其價(jià)格低廉、抗凍效果較好且不易發(fā)生美拉德反應(yīng)而廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，但此類(lèi)抗凍劑甜度和熱量相對(duì)較高，與當(dāng)前人們對(duì)健康飲食的追求不太相符，因此低甜度、低熱量的抗凍劑成為新的研究對(duì)象。目前海藻糖和甘露醇作為低熱量功能性糖醇類(lèi)抗凍劑受到越來(lái)越多關(guān)注。Sei等[3]發(fā)現(xiàn)海藻糖在抑制冰晶增長(zhǎng)和冰晶形態(tài)不穩(wěn)定方面，比蔗糖更具優(yōu)勢(shì)。薛勇等[4]采用10%海藻糖作為抗凍劑，測(cè)定凍藏后鳙魚(yú)肌原纖維蛋白性質(zhì)的變化，結(jié)果表明海藻糖的抗冷凍效果優(yōu)于蔗糖和山梨醇混合物。然而，目前關(guān)于海藻糖和甘露醇復(fù)配對(duì)反復(fù)凍融引起的肌原纖維蛋白氧化變性的影響還鮮有報(bào)道。

在眾多肉類(lèi)食品中，蝦蛄（Oratosquilla oratoria）作為一種營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美的海產(chǎn)品，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。蝦蛄收獲的季節(jié)性非常強(qiáng)，為便于保鮮，常采用低溫貯存。在貯藏加工過(guò)程中，蝦蛄肉品質(zhì)的變化直接影響其消費(fèi)價(jià)值，其中肌原纖維蛋白對(duì)蝦蛄產(chǎn)品的保水性、質(zhì)地等品質(zhì)都起著決定性作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以蝦蛄為對(duì)象，研究反復(fù)凍融處理對(duì)肌原纖維蛋白氧化、結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，探索凍融循環(huán)對(duì)蝦蛄蛋白品質(zhì)的影響規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，探討4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇抗凍劑對(duì)蝦蛄肌原纖維蛋白的冷凍保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用口蝦蛄捕自渤海灣（天津）近海海域，購(gòu)于天津市北辰區(qū)老板娘水產(chǎn)城。

海藻糖、甘露醇、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純 上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-E高效冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；U5100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、F-4600熒光分光光度儀、SU3500掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Physica MCR301高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System公司；POLYTRON PT 2100勻漿機(jī) 瑞士Kinematica公司。

1.3 方法

1.3.1 凍融循環(huán)處理

蝦蛄去頭、尾，剝殼，取肉剁碎。將蝦蛄肉糜分為兩份，每份1 000 g，一份為對(duì)照組，一份為實(shí)驗(yàn)組。將實(shí)驗(yàn)組肉糜浸泡在冷凍保護(hù)劑溶液中2 h，然后將瀝干的肉糜樣品（約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）放入聚乙烯自封袋中（5 份，每份200 g，分別編號(hào)為實(shí)驗(yàn)1、2、3、4、5組）。對(duì)照組做同樣的分組處理。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣品置于－20 ℃冰箱中冷凍，5 d后取出，室溫解凍至其中心溫度為0 ℃，然后放回－20 ℃冰箱中貯藏，此為一個(gè)凍融處理。從5 組樣品中隨機(jī)抽取3 份進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，然后將剩余樣品放回－20 ℃繼續(xù)冷凍5 d。依此方法分別進(jìn)行0、1、3、5 次凍融處理，并進(jìn)行相應(yīng)的指標(biāo)測(cè)定。考慮到目前工業(yè)上采用的商業(yè)抗凍劑為4%蔗糖＋4%山梨糖醇，因此本實(shí)驗(yàn)選擇4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇為冷凍保護(hù)劑溶液。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參考Park等[5]的方法。向肉糜中加入4 倍體積蛋白提取液（0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0），11 000 r/min勻漿25 s，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀，再加入蛋白提取液重復(fù)上述操作2 次得粗蛋白。將所得粗蛋白與4 倍體積0.1 mol/L NaCl溶液混合，勻漿25 s，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀，再加入NaCl溶液重復(fù)上述操作2 次即得蝦蛄肌原纖維蛋白。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 凍融循環(huán)對(duì)蝦蛄肌原纖維蛋白氧化及結(jié)構(gòu)的影響

1.3.3.1 羰基含量測(cè)定

采用DNPH法測(cè)定蛋白羰基含量[6]。取0.5 mL蛋白溶液（5 mg/mL）于離心管中，加入1 mL 10 mmol/L DNPH（溶于2 mol/L鹽酸），室溫避光反應(yīng)1 h，每隔10 min渦旋一次，然后加入等體積20%三氯乙酸溶液，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，所得沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）充分洗滌3 次，以除去未反應(yīng)的DNPH。加入4 mL鹽酸胍溶液（6 mol/L，溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.5），37 ℃溶解沉淀20 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液于370 nm波長(zhǎng)比色。羰基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)22 000 L/（mol?cm）計(jì)算?？瞻讓?duì)照組加入1 mL 2 mol/L鹽酸（不含DNPH），其余步驟同上。

1.3.3.2 總巰基含量測(cè)定

蛋白巰基含量通過(guò)DTNB法測(cè)定[7]。肌原纖維蛋白（5 mg/mL）溶解于含5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的Tris緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.0），80 ℃水浴45 min，8 000 r/min離心10 min。收集上清液用于巰基含量的測(cè)定。用相同緩沖液配制10 mmol/L DTNB。取0.5 mL上清液與2 mL 5% SDS/Tris緩沖液混合，隨后加入0.2 mL DTNB避光反應(yīng)30 min，混合液于波長(zhǎng)412 nm測(cè)定吸光度?？瞻滓?% SDS/Tris緩沖液替代蛋白樣品。采用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol?cm）計(jì)算總巰基含量。

1.3.3.3 表面疏水性測(cè)定

參考Chelh等[8]的方法。向1 mL肌原纖維蛋白分散液（5 mg/mL）中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB）（去離子水溶解）?？瞻捉M用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）替代。室溫下充分振蕩10 min，5 000 r/min離心15 min。取上清液稀釋10 倍后在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A。疏水性用BPB結(jié)合量表示，計(jì)算如式（1）所示：

1.3.3.4 內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度測(cè)定

色氨酸熒光強(qiáng)度的變化通過(guò)F-4600熒光分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)。用0.5 mol/L NaCl溶液將蛋白稀釋為質(zhì)量濃度0.04 mg/mL，室溫條件下于295 nm波長(zhǎng)處激發(fā)，記錄下310～400 nm波長(zhǎng)處發(fā)射光譜供后續(xù)分析。扣除溶劑發(fā)射光譜（在相同條件下獲得）以排除干擾。

1.3.4 凍融循環(huán)對(duì)蝦蛄肌原纖維蛋白凝膠性能的影響

1.3.4.1 動(dòng)態(tài)流變測(cè)試

根據(jù)Li Chunqiang等[9]的方法。將20 mg/mL蛋白樣品（分散于0.5 mol/L NaCl）置于離心管內(nèi)，于4 ℃離心1 min脫氣。將脫氣后的蛋白均勻涂布于流變儀的下平板上，將上平板降至1 mm時(shí)用柔軟的實(shí)驗(yàn)用紙輕輕擦去周?chē)嘤嗟臉悠罚⒃谶吘壨可瞎栌鸵苑兰訜徇^(guò)程中水分流失。在振蕩模式下以1 ℃/min的升溫速率加熱樣品，記錄20～80 ℃的升溫曲線(xiàn)。設(shè)置振蕩頻率為0.1 Hz，控制最大應(yīng)力為0.02。凝膠性能通過(guò)儲(chǔ)存模量（G’）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.4.2 凝膠強(qiáng)度及持水力測(cè)定

將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為40 mg/mL，取20 mL于平底玻璃瓶中，加蓋密封，水浴加熱。具體升溫程序如下：起始溫度20 ℃，以1 ℃/min線(xiàn)性升溫至73 ℃。加熱結(jié)束后，立即將樣品放入冰水混合物中冷卻30 min，然后置于4 ℃冰箱過(guò)夜。在測(cè)定凝膠性能之前，將凝膠樣品從4 ℃取出放在室溫下平衡2 h。利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定凝膠強(qiáng)度，選用P0.5圓柱探頭，測(cè)試全過(guò)程設(shè)定探頭速率均為1 mm/s，凝膠強(qiáng)度定義為破壞凝膠結(jié)構(gòu)需要的初始力。

凝膠持水力通過(guò)離心的方法測(cè)定。將一定質(zhì)量凝膠于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，記錄離心管（m）以及離心前后的總質(zhì)量分別為m1和m2。持水力的計(jì)算如式（2）所示：

1.3.4.3 掃描電子顯微鏡觀測(cè)凝膠微觀結(jié)構(gòu)

用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制2.5%戊二醛溶液固定凝膠樣品12 h，從而獲得樣品塊（3 mm×3 mm×3 mm）。然后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次，在30%、50%、70%、90%、95%和100%乙醇溶液中梯度脫水。最后將樣品冷凍干燥后即可進(jìn)行電子顯微鏡掃描。

1.3.5 凍融循環(huán)對(duì)蝦蛄肌原纖維蛋白乳化特性的影響

將8 mL 1 mg/mL的蛋白溶液與2.0 mL大豆油混合，15 000 r/min勻漿1 min，分別在第0、10分鐘時(shí)在距離心管底部0.5 cm處取100 μL勻漿液，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，混勻，以0.1% SDS為空白，500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性由式（3）、（4）計(jì)算：

式中：A500nm為500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)/%；A0和A10分別為第0、10分鐘時(shí)500 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融循環(huán)對(duì)蝦蛄肌原纖維蛋白氧化及結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 蛋白羰基

蛋白羰基側(cè)鏈含—NH—或—NH2的氨基酸非常容易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的氧化攻擊而轉(zhuǎn)化為羰基。因此，蛋白羰基含量的變化是目前最為廣泛用于衡量蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)。蛋白羰基產(chǎn)生途徑主要包括：氨基酸側(cè)鏈的氧化、肽鍵的斷裂、外源性羰基的引入（脂肪氧化產(chǎn)物中的醛類(lèi)以及酚類(lèi)物質(zhì)的氧化產(chǎn)物半醌或醌類(lèi)共價(jià)鏈接到蛋白側(cè)鏈）。一般來(lái)說(shuō)，羰基含量越高表明蛋白氧化程度越高。經(jīng)不同凍融次數(shù)處理后的蝦蛄肌原纖維蛋白羰基含量的變化如圖1所示。未經(jīng)凍融處理的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的蛋白羰基含量無(wú)差異，這說(shuō)明冷凍保護(hù)劑海藻糖和甘露醇對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量沒(méi)有影響。在進(jìn)行1、3、5 次凍融處理后，蛋白發(fā)生不同程度的氧化變性，表現(xiàn)為羰基含量顯著上升，尤其在反復(fù)凍融5 次后較未經(jīng)凍融的蛋白羰基含量增加了47.4%（P＜0.05）。這與姜晴晴等[2]的研究結(jié)果一致。海藻糖和甘露醇的添加有效抑制了氧化誘導(dǎo)的羰基含量上升：其抑制效率在5.2%～14.4%之間。在冷凍過(guò)程中，蝦蛄肉中的水分部分凍結(jié)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)濃度增加，同時(shí)，冰晶生長(zhǎng)的物理效應(yīng)會(huì)破壞肌肉細(xì)胞，導(dǎo)致線(xiàn)粒體和溶酶體酶等滲入肌漿中，從而加速蛋白、脂肪的氧化反應(yīng)[10]。冷凍保護(hù)劑如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇等可以降低肉品的冰點(diǎn)[11]，而且，海藻糖和甘露醇等可以與蛋白質(zhì)分子的功能基團(tuán)通過(guò)氫鍵或離子鍵相結(jié)合，這樣每個(gè)蛋白質(zhì)分子都被冷凍保護(hù)劑分子所包覆，降低了因反復(fù)凍融引發(fā)的凍結(jié)和氧化傷害[12]。

圖1 凍融處理對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effects of freeze-thaw cycles on carbonyl content of myofibrillar protein

2.1.2 總巰基含量

肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白組成，肌球蛋白約占其總量的43%，每分子含有40 個(gè)巰基，不含二硫鍵；肌動(dòng)蛋白約占22%，每分子含有5 個(gè)巰基，也不含二硫鍵。巰基易受自由基攻擊而轉(zhuǎn)化成二硫鍵。因此，巰基含量的減少以及二硫鍵的形成是蛋白氧化的重要前期指標(biāo)之一。由圖2可知，凍融處理對(duì)肌原纖維蛋白巰基含量的影響與羰基變化趨勢(shì)恰好相反。未經(jīng)凍融處理的蛋白總巰基含量約為（44.26±0.74）nmol/mg，凍融處理1、3、5 次后，巰基含量分別下降了12.7%、17.7%、37.6%。這與Benjskul等[13]在大西洋白鱈冰藏過(guò)程中得到的研究結(jié)果相似。反觀實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)1、3、5 次凍融處理后，蛋白巰基含量分別下降了6.2%、9.6%、25.5%，4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇顯著抑制了蛋白巰基含量的減少。在凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白巰基含量的下降可能是由于水形成冰結(jié)晶后，破壞肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使巰基暴露出來(lái)，進(jìn)而被氧化成二硫鍵使巰基含量下降。Hamre等[14]同樣發(fā)現(xiàn)，大眼海魚(yú)在－18 ℃冷藏時(shí)總巰基含量隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而下降，而二硫鍵含量卻上升。海藻糖和甘露醇等冷凍保護(hù)劑作為蛋白質(zhì)分子的防護(hù)屏障，能阻止肌肉中各種促氧化成分如自由基等對(duì)蛋白分子的攻擊，從而有效抑制蛋白巰基向二硫鍵的氧化轉(zhuǎn)化[15]。Li Yanqing等[16]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖和山梨糖醇對(duì)凍藏6 個(gè)月后的魚(yú)糜蛋白總巰基含量也有顯著的保護(hù)作用。Zhou Aimei[17]和Etemadian[18]等也得到了類(lèi)似的結(jié)論。

圖2 凍融處理對(duì)肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig. 2 Effects of freeze-thaw cycles on total sulfhydryl content of myofibrillar protein

2.1.3 表面疏水性

BPB可以結(jié)合于蛋白質(zhì)分子表面的疏水性位點(diǎn)，因此蛋白質(zhì)所能結(jié)合的BPB量可被用作反應(yīng)蛋白表面疏水性的指標(biāo)[8]。一般來(lái)說(shuō)，表面疏水性增加是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)的一個(gè)重要指標(biāo)。氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的疏水性氨基酸殘基使得蛋白表面疏水性增強(qiáng)。如圖3所示，與未經(jīng)凍融處理的蛋白樣品相比，經(jīng)1、3、5 次凍融處理的蛋白所結(jié)合的BPB量明顯上升，尤其是在5 次凍融循環(huán)后表面疏水性增加了1.48 倍，說(shuō)明反復(fù)凍融導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)、疏水性上升。這可能是因?yàn)閮鋈谔幚韺?dǎo)致蛋白質(zhì)氧化程度加深，表現(xiàn)為蛋白羰基化、肽主鏈的斷裂以及分子間二硫鍵的形成，蛋白質(zhì)解折疊，一些疏水性的脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)從蛋白分子內(nèi)部暴露，從而引起表面疏水性的增加[2,19]。海藻糖和甘露醇的添加對(duì)蛋白表面疏水性上升具有顯著的抑制作用，抑制率分別為10.7%（1 次凍融）、23.2%（3 次凍融）、19.6%（5 次凍融）。Herrera等[20]研究表明冷凍保護(hù)劑能減少非極性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的暴露，從而降低蛋白的表面疏水殘基數(shù)量，阻止蛋白分子因疏水相互作用引發(fā)的過(guò)度聚集。

圖3 凍融處理對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effects of freeze-thaw cycles on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.1.4 內(nèi)源色氨酸熒光

蛋白質(zhì)內(nèi)源性色氨酸熒光對(duì)于其周邊微環(huán)境的極性非常敏感。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時(shí)，色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核這樣的疏水環(huán)境中，此時(shí)被激發(fā)的色氨酸具有相對(duì)較高的熒光強(qiáng)度；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)部分或者完全展開(kāi)時(shí)，色氨酸殘基就會(huì)更多的暴露于蛋白質(zhì)分子表面，此時(shí)被激發(fā)的色氨酸熒光強(qiáng)度降低。因此，內(nèi)源性色氨酸熒光特性常被用于蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)[21]。如圖4所示，隨著凍融處理次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的熒光強(qiáng)度顯著下降，這表明蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)。反復(fù)凍融破壞了肌原纖維蛋白天然的排列方式，蛋白展開(kāi)變性使得原本位于內(nèi)部的色氨酸殘基暴露于表面而處于溶劑的極性環(huán)境中，從而引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降。添加海藻糖和甘露醇使熒光強(qiáng)度有不同程度回升，說(shuō)明在二者的保護(hù)作用下，蛋白分子變性程度較低，結(jié)構(gòu)變化相對(duì)較小，色氨酸殘基暴露少，這與上述表面疏水性結(jié)果相吻合。

圖4 凍融處理對(duì)肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光強(qiáng)度的影響Fig. 4 Effects of freeze-thaw cycles on tryptophan fl uorescence intensity of myofibrillar protein

2.2 凍融處理對(duì)蝦蛄肌原纖維蛋白凝膠性能的影響

2.2.1 動(dòng)態(tài)流變特性

圖5 凍融循環(huán)對(duì)肌原纖維蛋白在熱凝膠過(guò)程中彈性G’的影響Fig. 5 Effects of freeze-thaw cycles on storage modulus (G’) of myo fi brillar protein during thermal gelation

如圖5所示，未經(jīng)凍融的蛋白在加熱過(guò)程中出現(xiàn)兩個(gè)典型的流變轉(zhuǎn)變峰，其峰值分別在44 ℃和50 ℃左右，第1個(gè)峰的出現(xiàn)可歸因于肌球蛋白頭部變性及交聯(lián)，第2個(gè)峰應(yīng)是肌球蛋白尾部解旋并聚集的結(jié)果。在加熱早期階段，肌球蛋白的聚集主要是涉及二硫鍵交換的頭部-頭部結(jié)合，在隨后的加熱過(guò)程中是部分不可逆的尾部解螺旋及尾部-尾部交聯(lián)，緊接著就是三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[22]。

經(jīng)1、3、5 次凍融循環(huán)后，肌原纖維蛋白G′在第1個(gè)峰值處急劇下降，較未凍融蛋白分別下降了14.6%、70.4%、86.7%，且最終G′值也隨著凍融次數(shù)的增加而顯著下降，這說(shuō)明3 次及以上凍融循環(huán)嚴(yán)重破壞了肌原纖維蛋白的凝膠性能。此外，經(jīng)凍融處理的蛋白G′的起始上升溫度與轉(zhuǎn)變峰的溫度較未凍融蛋白均有所提前，可能由于反復(fù)凍融破壞了蛋白結(jié)構(gòu)，使得埋藏于蛋白分子內(nèi)部的活性官能團(tuán)暴露出來(lái)，從而加強(qiáng)了蛋白之間的相互作用[23]。海藻糖和甘露醇的添加顯著提高了蛋白在加熱過(guò)程中的G′，尤其在3、5 次凍融循環(huán)后，第1個(gè)轉(zhuǎn)變峰值較對(duì)照組分別提高了1 倍和2.8 倍。反復(fù)凍融導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性，結(jié)構(gòu)過(guò)度展開(kāi)，蛋白聚集沉淀，活性功能基團(tuán)被屏蔽，從而破壞蛋白凝膠性能。海藻糖和甘露醇等冷凍保護(hù)劑能與蛋白在連續(xù)相中相互作用，從而產(chǎn)生具有黏彈性的非晶態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[24]。Li Xingke等[25]的研究得到與本實(shí)驗(yàn)類(lèi)似的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì)鰱魚(yú)鹽溶蛋白的凝膠性能同樣有促進(jìn)作用。

2.2.2 凝膠強(qiáng)度及持水力

圖6 凍融循環(huán)對(duì)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度（A）和持水力（B）的影響Fig. 6 Effects of freeze-thaw cycles on gel strength (A) and waterholding capacity (B) of myofibrillar protein

如圖6所示，蝦蛄肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠強(qiáng)度隨著凍融次數(shù)的增加顯著下降（P＜0.05），蛋白經(jīng)1、3、5 次凍融循環(huán)處理后其凝膠強(qiáng)度較未凍融蛋白分別下降了20.2%、39.7%、56.4%。Erikson等[26]也發(fā)現(xiàn)凍藏會(huì)顯著降低三文魚(yú)里脊肌原纖維蛋白的凝膠硬度。4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇則可以有效抑制蛋白凝膠強(qiáng)度的下降，抑制效率在11.2%～33.6%之間。凍融循環(huán)導(dǎo)致蝦蛄肌球蛋白和肌動(dòng)球蛋白變性，以致于在隨后的熱處理過(guò)程中無(wú)法形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[27]，因此得到較低的凝膠強(qiáng)度。海藻糖和甘露醇的加入抑制了蛋白氧化和變性，降低蛋白聚集程度，Kong Baohua等[15]也證實(shí)了這一點(diǎn)。冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，使得肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的自由水被捕獲，有效阻止蛋白冷凍變性[27]。因此海藻糖和甘露醇可以提高蝦蛄蛋白的成膠能力，這與動(dòng)態(tài)流變結(jié)果一致。

凝膠持水力指凝膠保持自身水分或補(bǔ)充水分的能力，與凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的粗糙程度有關(guān)。蝦蛄肌原纖維蛋白凝膠持水力的變化趨勢(shì)與凝膠強(qiáng)度一致。肌球蛋白組分對(duì)凝膠的形成起關(guān)鍵作用[28]。樣品中肌球蛋白參與凝膠的程度隨著蝦蛄凍融次數(shù)的增加而降低，因此持水力也隨之下降。海藻糖和甘露醇的添加有利于凝膠持水力的提升，相較于對(duì)照組分別提高了7.1%（1 次凍融）、18.7%（3 次凍融）、29.0%（5 次凍融）。海藻糖和甘露醇等冷凍保護(hù)劑一方面可以通過(guò)氫鍵作用結(jié)合自由水，固定肉糜中的水分；另一方面也可以減少水分子在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的位移，從而提高持水力[27]。

2.2.3 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

圖7 凍融循環(huán)對(duì)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 7 Effects of freeze-thaw cycles on microstructure of myofibrillar protein gels

通過(guò)分析動(dòng)態(tài)流變、凝膠強(qiáng)度與持水力結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選取未經(jīng)凍融和經(jīng)3、5 次凍融處理的蛋白進(jìn)行凝膠微觀結(jié)構(gòu)表征。如圖7所示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的未凍融蛋白的熱制凝膠結(jié)構(gòu)致密，表面較為平整，孔隙分布均勻。經(jīng)3、5 次凍融處理后（放大掃描電子顯微鏡觀察倍數(shù)），蛋白凝膠結(jié)構(gòu)劣變且程度逐漸加深，產(chǎn)生大量不規(guī)則的聚集體，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不明顯，說(shuō)明肌原纖維蛋白在反復(fù)凍融過(guò)程中發(fā)生聚集，這與動(dòng)態(tài)流變、凝膠強(qiáng)度與持水力的結(jié)果一致。添加海藻糖和甘露醇顯著改善了蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為促使不規(guī)則的聚集體參與凝膠而形成多孔且孔徑均一有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)提高的凝膠強(qiáng)度及持水力。

2.3 凍融處理對(duì)蝦蛄肌原纖維蛋白乳化特性的影響

圖8 凍融循環(huán)對(duì)肌原纖維蛋白乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 8 Effects of freeze-thaw cycles on emulsifying properties of myofibrillar protein

如圖8所示，隨著凍融次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都顯著下降（P＜0.05），其中凍融處理5 次后乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降了31.6%，這與Xia Xiufang等[29]在豬肉中的研究結(jié)果一致。此結(jié)果表明，反復(fù)凍融破壞了肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致蛋白與脂肪交聯(lián)的能力下降，從而使其乳化活性及乳化穩(wěn)定性下降。添加海藻糖和甘露醇后，蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均有不同程度回升。蛋白的乳化性受眾多因素影響，其中蛋白變性是導(dǎo)致乳化能力下降的主要原因，氧化變性會(huì)限制蛋白在油滴表面吸附的靈活性[27]。此外，Srikar等[30]研究表明脂肪和游離脂肪酸的氧化產(chǎn)物也會(huì)降低蛋白的溶解性和乳化能力。結(jié)合研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)[15]，冷凍保護(hù)劑能顯著抑制蛋白羰基化和脂質(zhì)氧化，防止蛋白變性，從而起到穩(wěn)定乳狀液的作用。

糖醇類(lèi)物質(zhì)的抗凍作用機(jī)理是分子中的羥基與蛋白質(zhì)分子的某些功能基團(tuán)結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子處于飽和狀態(tài)，從而避免蛋白質(zhì)分子之間的聚集變性。同時(shí)，糖醇類(lèi)物質(zhì)的游離羥基還能有效地束縛水分子，從而降低“共晶點(diǎn)”溫度，減少冰晶體的形成量，形成一個(gè)不完全凍結(jié)區(qū)域，隔離和減緩蛋白質(zhì)分子的聚集，進(jìn)而防止蛋白質(zhì)的凝聚變性。一般，糖醇類(lèi)物質(zhì)的添加量與防止蛋白質(zhì)冷凍變性的效果呈正比[31]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究海藻糖和甘露醇對(duì)反復(fù)凍融引起的蝦蛄肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性變化的影響。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融處理，肌肉結(jié)構(gòu)完整性破壞，蛋白氧化變性，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)羰基含量和表面疏水性增加，總巰基含量和色氨酸熒光強(qiáng)度顯著下降，同時(shí)蛋白的功能性質(zhì)（凝膠和乳化特性）下降，影響其食用及加工利用品質(zhì)。而海藻糖和甘露醇的添加能有效抑制蛋白的變性程度，減少蛋白結(jié)構(gòu)的變化，顯著提高蛋白在熱凝膠過(guò)程中的G’，改善蛋白的凝膠特性（凝膠強(qiáng)度、持水力和三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)）、乳化活性和乳化穩(wěn)定性。海藻糖和甘露醇作為食品添加劑添加到低溫肉制品中，可改善肉品的膠著性、持水性和柔嫩性，減少營(yíng)養(yǎng)損失，提高產(chǎn)品質(zhì)量，具有廣闊的應(yīng)用前景。