閆鳴艷，趙曉晨，楊 蕭，許 豪，安祥生，李銀平*

（青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042）

膠原是動(dòng)物體內(nèi)含量最多分布最廣的一類結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白量的30%[1]，廣泛分布于動(dòng)物的皮膚、骨骼、軟骨、肌腱、角膜等部位[2]。其具有良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等功能[3]，因而在生物材料、組織工程、醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用。目前使用的膠原主要來(lái)源于豬、牛等陸生哺乳動(dòng)物，近年來(lái)由于瘋牛病、口蹄疫等人畜交叉流行病的頻發(fā)，豬和牛中來(lái)源膠原的應(yīng)用受到了限制[4]。在這種情況下，水產(chǎn)膠原由于原料豐富、易于提取、低抗原性、低致敏性、沒(méi)有傳染病危險(xiǎn)等而受到廣泛的關(guān)注[5]。羅非魚（Oreochromis niloticus）是我國(guó)最常見(jiàn)的淡水魚之一，近年來(lái)，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，出口量也逐年增長(zhǎng)，由此產(chǎn)生大量魚皮、魚骨、魚頭等副產(chǎn)物[6]，其中魚皮約占4.0%，而魚皮干物質(zhì)的70%以上為膠原[7]。目前羅非魚皮膠原已被加工成多肽應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域，然而近年來(lái)水產(chǎn)膠原基生物材料領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，將羅非魚皮膠原開(kāi)發(fā)成生物材料是提高水產(chǎn)加工附加值的另一條有效途徑。

自聚集性是膠原的內(nèi)在屬性，利用這一屬性膠原能夠在體外形成類似于天然膠原纖維結(jié)構(gòu)的纖維網(wǎng)絡(luò)[8]，這也是構(gòu)建膠原基生物材料及改善其性能最常用的技術(shù)手段[9]。膠原自聚集性易受外界因素的影響，如膠原濃度、溶液pH值、自聚集溫度、離子強(qiáng)度、紫外線、電場(chǎng)以及外源物質(zhì)等[3]。在生物體內(nèi)，膠原易與多糖類成分一起構(gòu)成一種有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)——細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)于機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和遷移具有非常重要的意義[10]，而在體外，多糖也經(jīng)常與膠原一起制備復(fù)合生物材料，因此探討多糖類物質(zhì)對(duì)膠原自聚集性影響的研究較多，如Tian Huilin等[11]探討了硫酸軟骨素對(duì)體外牛皮膠原纖維的重建的影響，閆鳴艷[7]研究了海藻酸鈉、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸和殼聚糖對(duì)羅非魚皮膠原自聚集性的影響。然而，對(duì)于其他構(gòu)建生物材料的氨基酸類生物大分子對(duì)膠原自聚集性影響的報(bào)道較少。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過(guò)γ-谷氨酰鍵聚合而成的直鏈狀氨基酸聚合物，表現(xiàn)良好的水溶性和生物降解性，并且安全無(wú)毒，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。該物質(zhì)可與其他物質(zhì)復(fù)合形成新型材料，如Otani等[14]利用明膠、聚谷氨酸和碳化二亞胺制備了一種快速固化膠水，具有較好的止血效果；Shi Lu等[15]利用γ-PGA和絲膠蛋白制備了一種新型水凝膠，用作創(chuàng)傷敷料。本研究將著重探討γ-PGA對(duì)羅非魚皮酶促溶性膠原自聚集性及膠原水凝膠微觀結(jié)構(gòu)和性能的影響，相關(guān)研究成果能夠?yàn)樗a(chǎn)膠原基生物材料的研究和開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于食品營(yíng)養(yǎng)成分的包埋緩釋也具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮由青島廠家提供，－20 ℃運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)4 ℃解凍。

胃蛋白酶、I型膠原酶 美國(guó)Sigma公司；γ-PGA（分子質(zhì)量為106Da） 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；氫氧化鈉、冰乙酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、叔丁醇、乙醇、Tris、濃鹽酸、考馬斯亮藍(lán)、十六烷基三甲基溴化銨均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CT14RD冷凍離心機(jī) 天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)、精密PHS-3C酸度計(jì)上海佑科儀器儀表有限公司；DKB-501S電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；S-4800掃描電鏡 日本Hitachi公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促溶性膠原的制備

酶促溶性膠原（pepsin-solubilized collagen，PSC）的制備參照Huang Yuru等[16]的方法。

1.3.2 膠原自聚集動(dòng)力學(xué)

參照閆鳴艷[7]的方法。稱取一定量膠原于4 ℃攪拌溶解于0.5 mol/L的醋酸溶液得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，20 000×g離心后取上清液。將該上清液與40 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）于冰浴中等體積混合，混合均勻后調(diào)節(jié)溶液pH 7.4，立即于28 ℃水浴中自聚集。

以40 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）為溶劑配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的γ-PGA溶液，20 000×g離心后取上清液。將該溶液與PSC溶液和磷酸緩沖液在冰浴中按照一定比例混合，使γ-PGA與PSC的質(zhì)量百分比分別為20%、40%、60%、80%和100%，磷酸緩沖液和膠原的終濃度分別為20 mmol/L和0.5 mg/mL，混合均勻后調(diào)節(jié)溶液pH 7.4，于28 ℃水浴中自聚集。

每2 min采用分光光度計(jì)測(cè)定溶液在400 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以第0分鐘時(shí)的膠原溶液為空白。依據(jù)文獻(xiàn)[7,17]的方法對(duì)膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行分析，以ln[（Ae－At）/（Ae－A0）]對(duì)時(shí)間作圖，針對(duì)不同階段數(shù)據(jù)進(jìn)行一元線性回歸分析，所得斜率即為膠原自聚集速率常數(shù)。其中，At、Ae和A0為自聚集PSC溶液在時(shí)間t、平衡階段和第0小時(shí)于400 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.3 自聚集比率

膠原自聚集完全后20 000×g離心30 min，收集上清液。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量；γ-PGA含量測(cè)定采用十六烷基三甲基溴化銨法[18]。自聚集比率即為上清液中某成分（PSC、γ-PGA）的降低比率，計(jì)算如式（1）所示：

1.3.4 掃描電鏡觀察

參照王響英等[19]的方法。膠原水凝膠于蒸餾水中浸泡脫鹽24 h（每8 h更換一次蒸餾水），在2%甲醛溶液中固定12 h后依次用30%、50%、70%、80%和90%叔丁醇-乙醇溶液脫水，最后于叔丁醇中脫水3 次，每次15 min。然后將脫水凝膠置于4 ℃條件下固化，凍干后固定于樣品臺(tái)上，真空噴金處理，加速電壓為10 kV在掃描電鏡下觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.5 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

膠原（4 mg/mL）在50 mL燒杯中自聚集形成高度為45 mm的水凝膠后，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其凝膠強(qiáng)度。采用直徑為10 mm的圓柱形平頭沖頭（TA-10），測(cè)試速率為0.5 mm/s，壓力為4.5 g，測(cè)定水凝膠被壓縮4 mm時(shí)的壓力。凝膠強(qiáng)度計(jì)算如式（2）所示：

式中：G為凝膠強(qiáng)度/（kN/m2）；F為壓力/g；r為圓柱形平頭沖頭半徑/mm。

1.3.6 耐酶性分析

將I型膠原酶（≥125 U/mg）溶于50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，調(diào)節(jié)pH 7.4，使酶添加量為10 U/mL。精確稱取一定質(zhì)量（m0）的樣品于酶液中，使酶總活力與樣品質(zhì)量比為600 U/mg，于37 ℃放置3.5 h，取出后立即在冰浴中終止反應(yīng)，用蒸餾水脫鹽后干燥稱量其質(zhì)量（m1）。降解率計(jì)算如式（3）所示：

1.3.7 熱穩(wěn)定性分析

膠原水凝膠熱穩(wěn)定性的測(cè)定參照Yunoki等[20]的方法。將在10 mL試管中高度為（40±3）mm的水凝膠放置于溫度為30 ℃的水浴中，保持30 min，觀察水凝膠的變化，然后以1 ℃為間隔依次升溫至50 ℃，并在每個(gè)溫度條件下保溫30 min，當(dāng)觀察到水凝膠開(kāi)始融化時(shí)記錄溫度，此時(shí)溫度即為水凝膠的熱變性溫度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Origin 7.5進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC自聚集動(dòng)力學(xué)的影響

圖1 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC自聚集動(dòng)力學(xué)曲線（a）及線性擬合關(guān)系（b）的影響Fig. 1 Effect of γ-PGA on the kinetic curve (a) and linear fi tting relationship (b) of PSC self-assembly from tilapia skin

表1 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC自聚集速率常數(shù)的影響Table 1 Effect of γ-PGA on the rate constant of PSC self-assembly from tilapia skin

在不同含量γ-PGA存在的條件下，羅非魚皮PSC的自聚集動(dòng)力學(xué)曲線均為S型（圖1a），表明膠原仍然表現(xiàn)較好的自聚集能力，但是當(dāng)γ-PGA/PSC達(dá)到60%及以上時(shí)，膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線線性增長(zhǎng)階段斜率逐漸降低，說(shuō)明膠原自聚集速率減緩，原因主要是γ-PGA的等電點(diǎn)偏酸性，而膠原自聚集pH 7.4，在此條件下γ-PGA帶大量的負(fù)電荷，其結(jié)合到PSC上后使得膠原所帶負(fù)電荷增加、分子間靜電斥力增大[21]。依據(jù)文獻(xiàn)[7,17]的自聚集動(dòng)力學(xué)理論對(duì)膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行分析（圖1b和表1），結(jié)果表明在γ-PGA存在的條件下，膠原的自聚集過(guò)程仍然包含兩個(gè)階段[11]：第1階段（成核階段），膠原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化形成晶核，但吸光度并未顯著增加；第2階段（生長(zhǎng)階段），在晶核的基礎(chǔ)上膠原分子進(jìn)一步生長(zhǎng)直至形成膠原纖維甚至纖維束，進(jìn)而形成宏觀三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[22]，表現(xiàn)為吸光度顯著增加直至穩(wěn)定。然而，在γ-PGA存在的條件下，膠原的自聚集動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生了變化。通過(guò)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)于純膠原來(lái)說(shuō)，第1和第2自聚集階段的分界點(diǎn)在10 min時(shí)，隨著γ-PGA含量的增加，分界點(diǎn)依次為12、12、16、18 min和18 min；采用一元線性回歸方法對(duì)每一階段的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)隨著γ-PGA含量的增加，膠原的成核時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，第1階段的速率常數(shù)顯著降低，主要與γ-PGA帶大量的負(fù)電荷有關(guān)；而第2階段的速率常數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，原因可能是γ-PGA有大量的側(cè)鏈羧基，有利于增加膠原間的結(jié)合位點(diǎn)，因而纖維生長(zhǎng)的速率常數(shù)是增加的，但是隨著其含量的增加，負(fù)電荷帶來(lái)的斥力是主要影響因素，因而速率常數(shù)降低。由表1還可以看出，第1階段的速率常數(shù)遠(yuǎn)低于第2階段，因此成核階段是影響膠原自聚集性的速控階段。圖2為γ-PGA對(duì)膠原自聚集比率的影響，可以看出當(dāng)γ-PGA/PSC不高于80%時(shí)，隨著其含量的增加，膠原自聚集比率沒(méi)有顯著變化，然而當(dāng)γ-PGA/PSC進(jìn)一步增加到100%時(shí)，其值顯著降低；而對(duì)于γ-PGA來(lái)說(shuō)，其自聚集比率是隨著含量的增加而顯著增加的，可能與γ-PGA含有大量側(cè)鏈羧基有關(guān)。

圖2 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC自聚集比率的影響Fig. 2 Effect of γ-PGA on the reconstruction rate of PSC self-assembly from tilapia skin

2.2 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

羅非魚皮PSC自聚集后能夠形成外觀為白色的水凝膠，γ-PGA對(duì)水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示，可以看出在不同含量的γ-PGA存在的條件下，水凝膠均呈現(xiàn)三維纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與豬皮[10]、牛皮[11]、羅非魚鱗[23]、江鼠大鰭鳠魚皮[24]、草魚皮和鱗[25]等膠原水凝膠結(jié)構(gòu)類似。但是在三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，膠原纖維間的致密度不同。當(dāng)γ-PGA/PSC增加到80%時(shí)，膠原纖維致密度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，然而當(dāng)其進(jìn)一步增加到100%時(shí)，纖維間的致密度下降，原因可能是在γ-PGA含量比較低的時(shí)候，其與PSC相互作用導(dǎo)致交聯(lián)位點(diǎn)增加，但是隨著γ-PGA的增多，大量的分子與PSC相互作用從而屏蔽了膠原分子本身的交聯(lián)位點(diǎn)。

圖3 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effect of γ-PGA on the microstructure of PSC gel from tilapia skin

2.3 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC水凝膠性能的影響

圖4 γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC水凝膠的凝膠強(qiáng)度和耐酶性的影響Fig. 4 Effect of γ-PGA on the gel strength and enzymatic resistance of PSC hydrogels from tilapia skin

膠原自聚集水凝膠結(jié)構(gòu)類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)，但是純膠原水凝膠在凝膠強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性、耐酶性等方面均存在不足，限制了其在生物材料等領(lǐng)域的應(yīng)用[26]。因此本實(shí)驗(yàn)探討γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC水凝膠性能的影響，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)γ-PGA/PSC增加到80%時(shí)，膠原水凝膠的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，但是當(dāng)其進(jìn)一步增加到100%時(shí)，其凝膠強(qiáng)度顯著下降，這主要與凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)，如前所述，當(dāng)γ-PGA/PSC增加到80%時(shí)，膠原纖維致密度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，然而當(dāng)其進(jìn)一步增加到100%時(shí)，纖維間的致密度下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)γ-PGA對(duì)膠原水凝膠的耐酶性非常不利，隨著其含量的增加，水凝膠的酶降解率顯著增加。前人研究表明I型膠原酶首先降解膠原螺旋區(qū)的775位甘氨酸殘基和776位亮氨酸殘基形成的肽鍵[27-28]，由此推測(cè)γ-PGA的引入導(dǎo)致了膠原纖維中氨基酸殘基的位置發(fā)生了改變，Gly-Leu被暴露出來(lái)導(dǎo)致更容易被膠原酶所降解；降解率顯著增加還可能與三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中膠原纖維間作用力較弱有關(guān)。此外，實(shí)驗(yàn)中對(duì)γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC水凝膠熱穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了探討，結(jié)果表明隨著γ-PGA含量的增加，膠原水凝膠熱穩(wěn)定性并未發(fā)生顯著變化，均在（47±1）℃開(kāi)始融化，可能是膠原纖維間作用力較弱導(dǎo)致的。綜上所述，γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC水凝膠的耐酶性和熱穩(wěn)定性并未顯示積極的影響，因此參照其他文獻(xiàn)[29-30]，在下一步研究中將引入交聯(lián)等技術(shù)改善復(fù)合水凝膠的性能。

3 結(jié) 論

γ-PGA對(duì)羅非魚皮PSC自聚集動(dòng)力學(xué)具有顯著影響，能夠延緩膠原晶核的形成，但是在γ-PGA/PSC不大于80%時(shí)可加快膠原纖維的生長(zhǎng)。自聚集后，膠原能夠形成外觀為白色的水凝膠，其微觀結(jié)構(gòu)為三維纖維網(wǎng)絡(luò)，γ-PGA能夠影響到纖維的致密度，在γ-PGA/PSC增加到80%時(shí)，網(wǎng)絡(luò)致密度表現(xiàn)增加趨勢(shì)，相對(duì)應(yīng)的凝膠強(qiáng)度也表現(xiàn)類似趨勢(shì)。然而，γ-PGA對(duì)膠原水凝膠的耐酶性和熱穩(wěn)定性并未表現(xiàn)積極的影響，因此下一步研究將引入交聯(lián)等技術(shù)進(jìn)一步改善水凝膠的性能。