陳 倫，陳霽暉，張 青，黃曉會(huì)，李莉霞，卜書(shū)紅

0 引言

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于乙狀結(jié)腸和直腸交界處，有較高的發(fā)病率和病死率。研究認(rèn)為，腫瘤發(fā)生為多基因的病理反應(yīng)[1]。近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)的快速發(fā)展，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞基因型不僅參與腫瘤分化、增殖及預(yù)后，還與癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān)，基因預(yù)測(cè)化療藥物毒副反應(yīng)備受臨床關(guān)注[2]。伊立替康為中晚期結(jié)直腸癌的常用化療藥物，在肝臟內(nèi)可快速水解為活性產(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿(SN-38)，抑制DNA單鏈斷裂后修復(fù)，影響DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到治療作用[3]。但SN-38主要通過(guò)尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族(UGTs)在肝臟中代謝，UGT1A1基因變異可降低UGT1A1表達(dá)，減少SN-38轉(zhuǎn)化，增加伊立替康所致的不良反應(yīng)[4-5]。既往研究報(bào)道，UGT1A1基因多態(tài)性和伊立替康所致的腹瀉、中性粒細(xì)胞減少有一定關(guān)系[6]，但此結(jié)論尚存爭(zhēng)議。本研究旨在探討UGT1A1基因與伊立替康致結(jié)腸癌患者腹瀉及中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系，從而指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2017年5月至2018年4月入院治療的60例結(jié)腸癌患者，入選標(biāo)準(zhǔn)[7]：均經(jīng)病理組織活檢確診為結(jié)腸癌；心肝腎等功能無(wú)明顯異常；預(yù)計(jì)生存時(shí)間超過(guò)3個(gè)月；距離最近1次化療或者手術(shù)時(shí)間超過(guò)4周；有可測(cè)量病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受放療；其他惡性腫瘤病史；嚴(yán)重多器官功能障礙；消化道及黃疸梗阻；造血功能不全；妊娠或者哺乳階段；既往接受過(guò)伊立替康治療；本研究藥物過(guò)敏禁忌證。男36例，女24例；年齡36～74歲，平均(60.35±9.38)歲；低分化腺癌23例，中、高分化腺癌37例。

1.2 治療方法 患者入院后均采用伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶治療，靜脈滴注125～180 mg/m2伊立替康，第1天；靜脈滴注400 mg/m2氟尿嘧啶和亞葉酸鈣200 mg/m2，第1～2天，1 600 mg/m2靜脈泵注維持46 h，3周為1個(gè)周期，均治療2～4個(gè)周期，患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)時(shí)，暫停給藥并給予對(duì)癥治療，待恢復(fù)至≤1級(jí)后再繼續(xù)治療，并將伊立替康劑量下調(diào)1個(gè)單位25 mg/m2。

1.3UGT1A1基因分型 收集患者治療結(jié)束時(shí)外周靜脈血3 ml，放置在抗凝管中，保存在-20 ℃低溫冰箱中待檢。取400 μl全血在2 ml離心管中，加入10 μl蛋白酶K、90 μl 10%異丙醇、410 μl STE溶液，搖晃2 min，放置在65 ℃水浴鍋中消化過(guò)夜。在充分消化血樣中加入300 μl飽和氯化鈉溶液，混勻后加入400 μl氯仿，混合均勻后在20 ℃環(huán)境中，在12 000 r/min離心機(jī)下離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，鍵入等體積的-20 ℃預(yù)冷異丙醇，混合均勻后，在4 ℃環(huán)境下離心15 min，除去上清液。在離心管中加入-20 ℃預(yù)冷75%乙醇溶液，按照以上離心條件離心15 min，去除上清液。并重復(fù)1次以上操作，室溫條件下晾干沉淀，加入100 μl Mili-Q水解液進(jìn)行沉淀。取1 μl DNA樣本，取1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本質(zhì)量，采用分光光度計(jì)測(cè)定樣本濃度及純度。取Mili-Q水稀釋樣本至10 ng/μl備用。參照Genbank的UGT1A1基因序列及配套軟件設(shè)計(jì)UGT1A1基因藥物遺傳多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物(UGT1A1*28：rs8175347，UGT1A1*6：rs4148323)。全部引物均由配套試劑盒提供，引物母液濃度為100 μmol/L，稀釋所有引物為1～10 μmol/L備用。取人外周血DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定PCR產(chǎn)物。用人外周血DNA為模板進(jìn)行touch down PCR擴(kuò)增，采用HRM方法進(jìn)行測(cè)定，用Bipedit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并分析基因類(lèi)型。

第1步不提取DNA，第2步不進(jìn)行擴(kuò)增。取患者外周血2 ml，EDTA抗凝處理；采用北京華夏時(shí)代基因發(fā)展科技有限公司提供的測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。提取白細(xì)胞后，采用熒光檢測(cè)儀對(duì)UGT1A1*28(rs8175347)和UGT1A1*6(rs4148343)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 藥物毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 患者入院后均查閱病歷，記錄性別、年齡、ECOG評(píng)分、轉(zhuǎn)移器官數(shù)目等資料。每個(gè)化療周期后，均查閱患者血液學(xué)檢查、病史等。采用美國(guó)國(guó)家研究所不良反應(yīng)分度標(biāo)準(zhǔn)4.0[8]評(píng)估患者化療后腹瀉、中性粒細(xì)胞減少情況，包含0～4級(jí)。①腹瀉。0級(jí)：無(wú)，1級(jí)：大便次數(shù)每天增加2～3次，2級(jí)：大便次數(shù)每天增加4～6次或者中度腹痛、夜間大便，3級(jí)：大便每天增加7～9次或者嚴(yán)重腹痛或者大便失禁，4級(jí)：大便每天增加10次或者需腸外支持治療或者明顯血性腹瀉。②中性粒細(xì)胞減少。0級(jí)：中性粒細(xì)胞≥2.0×109/L；1級(jí)：中性粒細(xì)胞1.5×109/L～1.9×109/L；2級(jí)：中性粒細(xì)1.0×109/L～1.4×109/L；3級(jí)：中性粒細(xì)胞0.5×109/L～0.9×109/L；4級(jí)：中性粒細(xì)胞<0.5×109/L。其中3、4級(jí)為嚴(yán)重不良反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0軟件包，計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，單因素分析有意義的因素用Logistic回歸方程進(jìn)行多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1UGT1A1不同基因型和伊立替康致腹瀉及中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系UGT1A1*28、UGT1A1*6突變基因型患者腹瀉、中性粒細(xì)胞減少發(fā)生率均分別高于野生型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細(xì)胞減少的單因素分析 單因素分析顯示，結(jié)腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細(xì)胞減少0～4級(jí)患者在不同性別、年齡、轉(zhuǎn)移器官數(shù)目、UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同ECOG評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、表3。

2.3 結(jié)腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細(xì)胞減少的Logistic回歸分析 將可能導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉、中性粒細(xì)胞減少的性別、年齡、轉(zhuǎn)移器官數(shù)目、UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量等因素納入Logistic回歸方程進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量是結(jié)腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細(xì)胞減少的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4、表5。

3 討論

結(jié)腸癌是嚴(yán)重危及患者生命安全的惡性腫瘤，近年來(lái)，隨著人們生活環(huán)境、飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。結(jié)腸癌的早期癥狀隱匿，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者糾正時(shí)已為中晚期，化療是此類(lèi)患者的重要治療手段。

伊立替康為半合成的可溶性喜樹(shù)堿衍生物，主要作用于細(xì)胞周期S期，通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，代謝為SN-38，影響DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[9-10]。盡管伊立替康在結(jié)腸癌治療中的效果已得到研究證實(shí)[11-12]，但隨著其在臨床的廣泛應(yīng)用，其所致的腹瀉及中性粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)較為突出，限制其使用。機(jī)體肝細(xì)胞內(nèi)SN-38在UGT1A1作用下轉(zhuǎn)化為SN-38G，通過(guò)膽汁排泄至腸道后，在β-葡萄糖醛酸酶作用下轉(zhuǎn)化為SN-38，血液及腸道中高濃度的SN-38又增加血液學(xué)毒性風(fēng)險(xiǎn)，增加腸壁炎癥細(xì)胞滲透性，促進(jìn)水及電解質(zhì)的分泌，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境改變，腸道內(nèi)菌群失調(diào)，從而引起腹瀉[13-14]。UGT1A1又可促進(jìn)SN-38轉(zhuǎn)化為SN-38G，從而減輕其不良反應(yīng)。侯慧軒等[15]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)患者出現(xiàn)伊立替康致嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率較歐美國(guó)家低，此差異一方面可能和國(guó)內(nèi)化療劑量有關(guān)，另一方面，有研究報(bào)道，UGT1A1基因多態(tài)性分布有明顯的種族差異，可能導(dǎo)致伊立替康在不同個(gè)體中的毒性反應(yīng)存在差異[16]。因此，分析UGT1A1基因多態(tài)性和伊立替康不良反應(yīng)間的關(guān)系有重要價(jià)值。

UGT1A1基因位點(diǎn)有多種突變，其中UGT1A1基因第28位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)TATA盒中的TA數(shù)目重復(fù)疊加差異可影響此基因多態(tài)性，TA插入延長(zhǎng)或者減少縮短均可減少UGT1A1基因合成，影響酶功能[17]。TA6/TA6是UGT1A1*28基因最常見(jiàn)的野生基因型，啟動(dòng)子區(qū)其次重復(fù)的主要為T(mén)A6/TA7雜合突變型。UGT1A1*6基因是由UGT1A1第一外顯子211位點(diǎn)出現(xiàn)單核苷酸替換所致，主要為野生型及雜合突變型，作用上和UGT1A1*28基因相似，能夠調(diào)控UGT1A1基因活性，此基因突變能夠降低患者對(duì)SN-38的代謝能力[18]。

表1 UGT1A1不同基因型和伊立替康致腹瀉及中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系(例，%)

表2 結(jié)腸癌患者伊立替康致腹瀉的單因素分析(例，%)

表3 結(jié)腸癌患者伊立替康致中性粒細(xì)胞減少的單因素分析(例，%)

表4 結(jié)腸癌患者伊立替康致腹瀉的Logistic回歸分析

表5 結(jié)腸癌患者伊立替康致中性粒細(xì)胞減少的Logistic回歸分析

陳茹等[19]研究報(bào)道，UGT1A1基因多態(tài)性可增加伊立替康治療結(jié)腸癌患者腹瀉、中性粒細(xì)胞減少的危險(xiǎn)性。本研究結(jié)果顯示，UGT1A1*28基因、UGT1A1*6基因型和嚴(yán)重腹瀉、中性粒細(xì)胞減少患者有良好相關(guān)性，以上基因突變型患者腹瀉的發(fā)生率明顯高于野生型，同時(shí)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，性別、年齡、轉(zhuǎn)移器官數(shù)目和嚴(yán)重腹瀉、中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生無(wú)關(guān)，排除了其對(duì)伊立替康所致毒性反應(yīng)的影響，進(jìn)一步說(shuō)明UGT1A1基因多態(tài)性和腹瀉的關(guān)系。臨床治療實(shí)踐中，不可避免地根據(jù)患者自身經(jīng)濟(jì)、個(gè)人體質(zhì)等調(diào)整伊立替康劑量，可能影響伊立替康所致不良反應(yīng)，既往已有研究報(bào)道，伊立替康不良反應(yīng)受化療劑量的影響[20]，本研究也支持此結(jié)論，因此，臨床應(yīng)綜合考慮UGT1A1*28、UGT1A1*6的影響。但本研究未進(jìn)一步分析伊立替康劑量和UGT1A1的關(guān)系，加上樣本量缺乏代表性，因此UGT1A1基因型和伊立替康劑量的關(guān)系認(rèn)識(shí)尚需大樣本研究證實(shí)，加上性別、年齡、轉(zhuǎn)移器官數(shù)目等因素可能存在一定的交互影響，進(jìn)一步分析各個(gè)因素之間的相關(guān)性，得出的結(jié)果可能更加可靠。

綜上所述，UGT1A1基因與伊立替康所致結(jié)腸癌患者腹瀉及中性粒細(xì)胞減少有關(guān)，可為臨床伊立替康不良反應(yīng)的干預(yù)及用藥選擇提供理論依據(jù)。