熊 輝

乳腺癌的發(fā)病率和致死率較高，是最為常見(jiàn)的也是對(duì)女性健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。這兩年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，臨床上治療癌癥已經(jīng)深入到對(duì)于一些基因的的研究，一般情況下我們?cè)谂R床上常見(jiàn)的抗癌基因有許多，較為多見(jiàn)的是p53、p21、p27等等。p53基因目前在臨床上被研究的許多，也是與腫瘤最相關(guān)的基因之一，對(duì)于p35基因的研究可以進(jìn)一步說(shuō)明腫瘤的發(fā)生的機(jī)制，有利于臨床對(duì)于腫瘤的研究[2]。針對(duì)這種問(wèn)題，本研究選取我院收治的乳腺癌患者120例，探討p53基因突變?cè)谌橄侔┌l(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制及與預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2017年1月我院收治的乳腺癌患者120例，均通過(guò)病理切片和影像檢查手段予以確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過(guò)西醫(yī)和傳統(tǒng)的中醫(yī)診斷予以確診；年齡≥25歲；對(duì)本研究治療無(wú)相關(guān)禁忌；預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；體檢結(jié)果顯示肝功能、腎功能、血糖等生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：心臟等臟器嚴(yán)重受損或者患有出血性相關(guān)病癥的病患；處于哺乳妊娠期的女性病患；治療過(guò)程中出現(xiàn)感染，尚未得到控制的病患；藥物性過(guò)敏體質(zhì)的病患。所選患者，年齡29～53歲之間，平均年齡(32.5±1.2)歲，病程2～5年，平均病程(3.23±0.21)年；按乳腺癌TNM分期，其中Ⅰ期患者35例，Ⅱ期患者30例，Ⅲ期患者27例，Ⅳ期患者28例。所選患者均知情同意本研究，并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

蛋白印跡法測(cè)定蛋白表達(dá)情況：首先是蛋白變性：向蛋白中按比例加入上樣緩沖液(不要全部蛋白都加)，之后放入沸水中煮10 min，冷卻后分裝，放入冰箱保存。制膠：采用蒸餾水、丙烯酰胺、Tris-Hcl、SDS、過(guò)硫酸銨、TEMED等原料進(jìn)行制膠。灌膠：將檢漏的水倒出，用濾紙吸干。倒入適量的分離膠，用水液封(加水時(shí)，緩慢地來(lái)回加，注意不要將膠沖壞)。靜置30 min左右(當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了)待膠凝了之后，將上層水倒出，并用吸水紙將水吸干(用marker筆標(biāo)記一下分離膠和濃縮膠的分界)。將濃縮膠沿玻璃板流下以免產(chǎn)生氣泡，將梳子水平插入濃縮膠中，注意不要產(chǎn)生氣泡。將倒在槽里的膠吸出，靜置30 min左右，待膠凝固。再進(jìn)行上樣：即對(duì)所采集的樣品進(jìn)行分裝標(biāo)記后分別上樣。電泳：電壓為80 V，電流為120 A，跑到濃縮膠分離膠分界處。再繼續(xù)用電壓120 V，電流120 A跑完分離膠。開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)膜：把2個(gè)海綿墊、6張濾紙泡在轉(zhuǎn)膜液中。將夾子打開(kāi)，平放在桌面上，在夾子上先鋪1個(gè)海綿墊，再鋪3張濾紙，注意濾紙與濾紙之間不要有氣泡。將膠按需要切好，平放在濾紙上，注意不要有氣泡。將PVDF膜剪成和膠一樣大小，放在甲醇中活化。將PVDF膜覆蓋在膠上，不要產(chǎn)生氣泡，再在上面鋪3張濾紙，注意不要有氣泡產(chǎn)生，再鋪上1個(gè)海綿墊。將夾子加好，放到轉(zhuǎn)膜儀里，倒入適量的轉(zhuǎn)膜液，蓋上蓋子放到箱子里，在轉(zhuǎn)膜儀周圍加冰。轉(zhuǎn)膜(電壓：300 V，電流：200 mA)，一般是2 h 10 min。最后一步是免疫反應(yīng)。脫脂奶粉封閉：5 ml TBST將0.25 g奶粉溶解，搖床1 h。從脫脂奶粉中將膜拿出，用1×TBST洗一下。一抗過(guò)夜：過(guò)夜后，拿出，用1×TBST搖床洗3次，一次10 min。二抗孵育：用二抗搖床1 h。用1×TBST搖床洗3次，一次10 min。

PCR方法，具體步驟為：AMV合成cDNA的第一條鏈(康為)，首先去除基因組DNA反應(yīng)，其次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，第cDNA擴(kuò)增(生工&康為)。①模板DNA準(zhǔn)備：基因組DNA，反應(yīng)體系中模板濃度推薦范圍1～10 μg/ml；質(zhì)?；蚴删wDNA濃度0.1～1 ng/ml。②引物準(zhǔn)備：引物濃度推薦范圍0.05～1 μmol/l。③在無(wú)菌潔凈的PCR管中依次加入溶液。最后PCR瓊脂糖凝膠電泳：取1～10 μl PCR 產(chǎn)物，微量移液器加入到2%的瓊脂糖凝膠樣品孔中，接通電極，使DNA在100 mA，110 V恒壓下向陽(yáng)極泳動(dòng)20 min。

1.3 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)PCR結(jié)果以及蛋白印跡法結(jié)果判斷p53的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 p35基因在不同分期下的突變情況

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，120例乳腺癌患者中p53突變80例，突變率為66.67%；p53基因在不同分期下的突變情況不同，在Ⅰ～Ⅱ期 的突變率明顯高于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 p53基因在不同分期下的突變情況對(duì)比(例，%)

2.2 乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的關(guān)系

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，在乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的關(guān)系分析中，患者p53基因突變情況與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰陽(yáng)性有明顯的關(guān)系(χ2=5.332，P<0.05)；見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的關(guān)系/例

2.3 不同腫塊大小與p53蛋白表達(dá)情況比較

p53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性百分率在腫塊>2.5 cm乳腺癌組織中表達(dá)率明顯低于腫塊<2.5 cm的乳腺癌組織(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同腫塊大小與p53蛋白表達(dá)情況比較(例，%)

3 討論

乳腺癌是一種較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，尤其在女性患者的患病率與發(fā)病極高[3]。臨床實(shí)踐中，乳腺癌的發(fā)病率和致死率較高，是最為常見(jiàn)的也是對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[4]。乳腺癌有著比較明顯的特點(diǎn)，如病患人群的年齡逐漸年輕化；多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，喪失了最佳診療時(shí)機(jī)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前對(duì)于癌癥的治療已經(jīng)從原來(lái)的細(xì)胞水平逐漸發(fā)展到分子水平[5]，所以對(duì)乳腺癌進(jìn)行分子水平分析是非常必要的。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，p53基因在人類基因組中是一種抑癌基因，和原癌基因一起在體內(nèi)發(fā)揮著調(diào)控癌基因的表達(dá)。這種抑癌基因的主要作用是維持細(xì)胞正常的生長(zhǎng)與分裂。當(dāng)細(xì)胞受到外來(lái)傷害時(shí)會(huì)發(fā)生DNA的斷裂，細(xì)胞具有自動(dòng)修補(bǔ)的能力，在對(duì)基因進(jìn)行修補(bǔ)時(shí)p53基因能使細(xì)胞分裂終止在G1/S期，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的無(wú)限增殖起到一定的限制作用。如果在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的損傷不能夠自行修復(fù)，那么則會(huì)發(fā)生細(xì)胞無(wú)限制的增殖，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)程序性死亡，進(jìn)而使得癌細(xì)胞不能夠持續(xù)增殖，使得機(jī)體正常。而在一些情況中，p53基因會(huì)出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象在增殖調(diào)控過(guò)程中，大多發(fā)生在腫瘤的早期。本文研究發(fā)現(xiàn)，p53基因發(fā)生突變?cè)诘谝黄谂c第二期較多。p53基因進(jìn)行轉(zhuǎn)路與翻譯后表達(dá)成為p53蛋白，這種蛋白參與細(xì)胞的分裂周期，其相對(duì)分質(zhì)量大約在53000，這也是p53蛋白進(jìn)行命名的原因。在一般情況下，p53蛋白進(jìn)行表達(dá)之后進(jìn)行誘導(dǎo)癌基因mdm2表達(dá)，MDM2蛋白與p53基因結(jié)合后抑制p53基因表達(dá)[6]。所以在一般情況下，p53蛋白在一般人體細(xì)胞與組織中的半衰期都很短，一般表達(dá)水平較低。但是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激后或者體內(nèi)癌細(xì)胞發(fā)生活化后，p53蛋白會(huì)進(jìn)行磷酸化，p53/MDM2蛋白間相互作用受影響，p53蛋白積聚，盡管在體內(nèi)發(fā)揮著生物學(xué)作用。p53蛋白阻止細(xì)胞分裂，使之出現(xiàn)G1期的阻滯。本文研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的分析中，患者p53基因突變情況與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰陽(yáng)性有明顯的關(guān)系(P<0.05)；p53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性百分率在腫塊>2.5 cm乳腺癌組織中表達(dá)率明顯大于腫塊<2.5 cm的乳腺癌組織(P<0.05)。

在正常人體內(nèi)，從出生到長(zhǎng)大，體內(nèi)細(xì)胞無(wú)時(shí)無(wú)刻不再發(fā)生著細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡(cell apoptosis)也就是細(xì)胞程序性死亡，它是一種正常的生理現(xiàn)象。它與細(xì)胞壞死有著本質(zhì)的區(qū)別，細(xì)胞壞死是體內(nèi)不正常的病理現(xiàn)象。在形態(tài)學(xué)上進(jìn)行觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的細(xì)胞其染色質(zhì)會(huì)出現(xiàn)沉淀的現(xiàn)象，細(xì)胞的體積會(huì)縮小，形成凋亡小題后會(huì)被吞噬細(xì)胞吞噬。因?yàn)樵诩?xì)胞凋亡過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)溶酶體的破壞與釋放，所以一般不能出現(xiàn)周圍組織的炎癥反應(yīng)的破壞。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，p53基因在誘發(fā)細(xì)胞凋亡中起重要作用，有誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的功能?？傮w來(lái)說(shuō)，p53基因的作用主要有三個(gè)方面：一是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期，是細(xì)胞生長(zhǎng)保留在G1期；二是可以對(duì)損傷的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)；三是參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而p53基因突變后這些功能都不能發(fā)揮。

綜上所述，p53基因突變發(fā)生在乳腺癌早期，另外p53基因突變可作為乳腺癌治療的預(yù)后指標(biāo)，值得臨床上進(jìn)行推廣與應(yīng)用。