向 陽，楊晨晨,韓曾嬌，常軍民

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

刺糖為駱駝刺的分泌物[1]。多糖是一種毒性極小的藥物，其作為廣譜免疫促進(jìn)劑，具有抗感染、抗凝血、降血糖、降血脂、促進(jìn)生物合成等特點(diǎn)[2-5]，被認(rèn)為是天然化合物保健品。刺糖中的多糖即刺糖多糖在降血糖、抗氧化、免疫活性、抗腫瘤方面具有重要的研究?jī)r(jià)值[6-10]。信號(hào)通路是多糖參與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的一個(gè)重要途徑，本研究主要探討不同濃度刺糖多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinases，ERK1)、ERK2及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號(hào)通路中的JNK1、JNK2、JNK3和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor，NF-κB)信號(hào)通路中的NF-κB、p65、p38 mRNA與蛋白表達(dá)的影響，為研究刺糖多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的信號(hào)通路提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；刺糖藥材購(gòu)自新疆維吾爾民族醫(yī)院(批號(hào)：20140801)，由新疆醫(yī)科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室帕麗達(dá)教授鑒定為刺糖(Alhagi-honey)；Fast Quant RT Kit(With gDNase)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium，BCA)蛋白定量試劑盒(PA115-02)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，SYBR Select Master Mix(4472920)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(AR0105)、蛋白酶抑制劑(AR1178)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，Anti-NF-κB p65、Anti-JNK1+JNK2+JNK3、Anti-p-(ERK1/2)、Anti-(ERK1/2)、Anti-p38MAPK購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，磷酸化p38 MAPK (phospho-p38 MAPK，p-p38 MAPK)(Thr180/Tyr182)購(gòu)自德國(guó)CST公司;漩渦混合器(JK-41B)、核酸蛋白定量?jī)x(K3507)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(MUA2-7E)購(gòu)自德瑞儀器有限公司，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Mini-PROTEAN Tetra system)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，纖維素柱色譜(DEAE sepharose CL-6B)、葡聚糖凝膠柱色譜(Sephadex G-100)購(gòu)自北京冬歌生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺糖多糖的制備原藥材刺糖經(jīng)過水提醇沉、石油醚脫脂、水浴回流提取、減壓濃縮得到刺糖粗多糖，體積分?jǐn)?shù)50%醇沉提刺糖粗多糖,依次通過AB-8大孔吸附樹脂、纖維素柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜，0.1 mol·L-1的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，濃縮干燥得到刺糖多糖粉末。將刺糖多糖粉末使用達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基細(xì)胞完全培養(yǎng)液稀釋為0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖溶液備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7，使用達(dá)爾伯克改良伊格爾完全培養(yǎng)液稀釋至1×108L-1，接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加500 μL細(xì)胞混懸液，24 h后棄去培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組，加入500 μL相應(yīng)濃度的刺糖多糖溶液，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后終止，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA表達(dá)采用TRIzol法提取各組細(xì)胞中RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA表達(dá)。ERK1上游引物序列為5′-TCCTTTTGGATCTGGTCCTG-3′，下游引物序列為5′-CCCCAGCAAAGTGAGAGAAG-3′；ERK2上游引物序列為5′-GGTTGTTCCCAAATGCTGAC-3′，下游引物序列為5′GAGCCTGTTCAACTTCAATCC-3′；JNK1上游引物序列為5′-TCTGTTAGTCAGCGGAGCG-3′，下游引物序列為5′-GGCCGCTACTCAATCCTGTT-3′；JNK2上游引物序列為5′-TGGGGTAAAAGACCA-GCCTTC-3′，下游引物序列為5′-TGGGGTAAAAGA-CCAGCCTTC-3′；JNK3上游引物序列為5′-GTCTCCC-TCCATCCTCGTCTG-3′，下游引物序列為5′-CGGCTAGTCACCTGCAACAAC-3′；NF-κB p65上游引物序列為5′-GGACCCTGACCATGGACGAT-3′，下游引物序列為5′-AGCGCCCCTCGCATTTATAG-3′；p38上游引物序列為5′-CACGACCCTGATGAT-GAGCC-3′，下游引物序列為5′-GGTGGCACAAAGC-TGATGAC-3′。20 μL反應(yīng)體系：SYBR Select Master Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，退火溫度60 ℃，退火與延伸1 min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)源參照，分析各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，加入800 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，充分混勻。4 ℃放置60 min后冰上勻漿，以 12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，收集上清液；采用BCA法測(cè)定蛋白濃度并標(biāo)準(zhǔn)化。將樣品加入上樣緩沖液，煮沸 5 min，蛋白變性后上樣，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。于50 g·L-1奶粉中室溫封閉2 h；將膜轉(zhuǎn)入含50 g·L-1牛奶的一抗溶液中，一抗?jié)舛确謩e為p-p38(11 000)、p38(1500)、p-NF-κB p65(1300)、NF-κB p65(1500)、p-ERK1/ERK2(1500)、ERK1/ERK2(1500)、p-JNK1/2/3(1500)、JNK1/2/3(1500)，4 ℃孵育過夜；去一抗，洗膜并加入二抗于室溫孵育1 h。轉(zhuǎn)膜后用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照。通過Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到經(jīng)過刺糖多糖干預(yù)后各基因表達(dá)量的條帶圖，蛋白相對(duì)表達(dá)量=各基因表達(dá)條帶吸光度值/內(nèi)參條帶吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見表1。刺糖多糖干預(yù)巨噬細(xì)胞24 h后，與0.0 mg·L-1刺糖多糖組比較，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中ERK1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中p38 mRNA表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與12.5 mg·L-1刺糖多糖組比較，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中ERK1、p38、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。100.0 mg·L-1與50 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中ERK1、p38、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中ERK2、JNK1、JNK2、JNK3 mRNA表達(dá)量組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同濃度刺糖多糖干預(yù)后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

組別ERK1ERK2JNK1JNK2JNK3p38NF-κB p650.0 mg·L-1刺糖多糖組1.007±0.162 1.017±0.230 1.030±0.289 1.017±0.203 1.007±0.124 1.003±0.150 1.017±0.237 12.5 mg·L-1刺糖多糖組1.650±0.4601.093±0.0151.080±0.1021.183±0.6540.987±0.1721.373±0.059a1.257±0.07450.0 mg·L-1刺糖多糖組2.110±0.622ab1.190±0.2590.993±0.1801.200±0.0891.097±0.0911.700±0.115ab1.887±0.165ab100.0 mg·L-1刺糖多糖組2.267±0.283ab1.323±0.1441.060±0.1801.107±0.1361.083±0.2102.000±0.254ab2.087±0.336ab

注：與0.0 mg·L-1刺糖多糖組比較aP<0.05；與12.5mg·L-1刺糖多糖組比較bP<0.05。

2.2 4組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAN264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見表2和圖1。與0.0、12.5 mg·L-1刺糖多糖組比較，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。100.0 mg·L-1刺糖多糖組與50.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中p38、NF-κB p65、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白表達(dá)量組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 不同濃度刺糖多糖干預(yù)后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

組別p-p38p38p-NF-κB p65NF-κB p65p-ERK1/ERK2ERK1/ERK2p-JNK1/2/3JNK1/2/30.0 mg·L-1刺糖多糖組0.319±0.0450.697±0.0060.439±0.0880.887±0.0050.410±0.0621.060±0.0020.478±0.0101.037±0.05912.5 mg·L-1刺糖多糖組0.499±0.0400.689±0.0530.477±0.0500.854±0.0520.464±0.0331.009±0.0550.490±0.0090.963±0.00350.0 mg·L-1刺糖多糖組0.680±0.127ab0.772±0.1150.753±0.141ab0.897±0.0420.680±0.065ab1.022±0.010ab0.461±0.0390.946±0.021100.0 mg·L-1刺糖多糖組0.673±0.071ab0.720±0.0470.849±0.026ab0.871±0.0520.714±0.019ab1.076±0.035ab0.476±0.0220.982±0.066

注：與0.0 mg·L-1刺糖多糖組比較aP<0.05；與12.5 mg·L-1刺糖多糖組比較bP<0.05。

A1、A2:0.0 mg·L-1刺糖多糖組；B1、B2：12.5 mg·L-1刺糖多糖組；C1、C2：50.0 mg·L-1刺糖多糖組；D1、D2：100.0 mg·L-1刺糖多糖組。

圖1 不同濃度刺糖多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白的表達(dá)

Fig.1 Expression of p-p38,p38,p-NF-κB p65,NF-κB p65,p-ERK1/ERK2,ERK1/ERK2,p-JNK1/2/3,JNK1/2/3 proteins in peritoneal macrophages of mice in the groups of different concentrations of polysaccharides

3 討論

真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在的2種介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和NF-κB信號(hào)通路[11-12]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在3條與炎癥密切相關(guān)的經(jīng)典MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即p38通路、ERK通路和JNK通路。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，激活p38/MAPK通路中特定細(xì)胞將導(dǎo)致細(xì)胞增殖被抑制，p38α還可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)入靜止期，并促進(jìn)DNA修復(fù)，從而抵抗化學(xué)治療誘導(dǎo)的DNA損傷，p38β在各種細(xì)胞系中有抗凋亡效果，且可能直接影響腫瘤浸潤(rùn)和遷移[13-14]。MAPK家族主要成員ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK均可參與對(duì)炎癥的調(diào)控[15]。NF-κB是調(diào)控免疫應(yīng)答的一組多效型轉(zhuǎn)錄因子，其主要發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、免疫炎癥反應(yīng)的作用，在巨噬細(xì)胞激活中具有重要作用。

本研究探討刺糖多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響及可能的調(diào)控機(jī)制，應(yīng)用Western blot及qRT-PCR檢測(cè)p38/MAPK和NF-κB等信號(hào)通路活化情況。通過Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到經(jīng)過刺糖多糖干預(yù)后各基因表達(dá)量的條帶圖，從p-p38和p38表達(dá)量條帶圖中可以看出，各濃度刺糖多糖干預(yù)巨噬細(xì)胞RAW264.7后，可誘導(dǎo)p38磷酸化水平明顯上升。在0.0～100.0 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，條帶逐漸加深，隨著刺糖多糖濃度的升高，p-p38蛋白表達(dá)量明顯升高，呈劑量相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中ERK1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量高于0.0 mg·L-1刺糖多糖組；12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中p38 mRNA表達(dá)量高于0.0 mg·L-1刺糖多糖組；50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中ERK1、p38、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量高于12.5 mg·L-1刺糖多糖組；50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2蛋白表達(dá)量高于0.0、12.5 mg·L-1刺糖多糖組，說明刺糖多糖干預(yù)巨噬細(xì)胞RAW264.7 24 h后激活了MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)p38、NF-κB p65、ERK1 mRNA表達(dá)水平呈濃度梯度升高，上調(diào)p38、NF-κB p65、ERK1/2蛋白的磷酸化水平，而JNK mRNA和蛋白水平無顯著變化，提示刺糖多糖可能參與了MAPK和NF-κB信號(hào)通路，但不參與JNK信號(hào)通路。

綜上所述，刺糖多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，調(diào)控著基因和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，且能上調(diào)巨噬細(xì)胞RAW264.7中NF-κB和MAPK信號(hào)通路中相關(guān)因子表達(dá)水平。進(jìn)一步深入研究刺糖多糖參與激活巨噬細(xì)胞的其他信號(hào)通路，對(duì)于多糖類免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)具有指導(dǎo)意義。