劉 佟，楊留勤，武莉萍，高國偉，吳冬梅，仁民柱，袁東方，董國艷

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第四臨床學院放療科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

結(jié)直腸癌是世界上常見的癌癥之一，近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢[1-2]，其病理類型多數(shù)為腺癌，約40%的患者能在早期得到診斷[3]。目前，對結(jié)直腸癌患者的篩查多采用隱血試驗，但其敏感性低，常導致漏診，結(jié)腸鏡檢查已被公認為結(jié)直腸癌診斷的金標準，但因其操作具有侵襲性、患者常有疼痛等不適感及其價格昂貴限制了其使用。此外，幾種血清標志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖類抗原19-9(carcinoembryonic antigen 19-9，CA19-9)和腫瘤特異性生長因子(tumor specific growth factor，TSGF)已被應用于結(jié)直腸癌的早期診斷，但它們診斷結(jié)直腸癌的臨床效果仍存在爭議[4]。雖然直腸癌的治療方法在不斷發(fā)展進步，但其治療后總體5 a生存率仍無顯著提高[5]。因此，尋找新的與結(jié)直腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后相關的特異性標志物顯得尤為重要。Rab蛋白是Ras超家族成員中最大的分支，參與調(diào)控真核細胞中囊泡介導的轉(zhuǎn)運，家族成員包括Rab3、Rab-3A、Rab-3B、Rab-3C與Rab-3D，其中Rab-3D表達的蛋白為Rab-3D蛋白，Rab-3D與三磷鳥苷(guanosinetriphosphate,GTP)結(jié)合，在人體中廣泛表達，尤其是在癌細胞系中表達明顯增高[6]。有文獻報道，Rab-3D在食管癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達[7]。本研究應用免疫組織化學方法，分析Rab-3D在結(jié)直腸腺癌癌組織、癌旁組織及正常組織中表達情況及其與患者臨床特征的關系，探討Rab-3D在結(jié)直腸腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年10月至2018年5月于新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院行結(jié)直腸腺癌切除術患者的標本為研究對象。共納入74例患者，其中男38例，女36例；年齡42～87(54.51±11.32)歲；直腸腺癌38例，結(jié)腸腺癌36例；腫瘤直徑>5 cm者32例，≤5 cm 者42例；高分化腺癌8例，中分化腺癌50例，低分化腺癌16例；參照國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control,UICC)2002標準，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期45例，Ⅲ+Ⅳ期29例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。取患者術后腺癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣2～3 cm)(n=40)及正常組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)(n=40)。所有標本經(jīng)組織病理學檢查確診，患者術前均未接受放射、化學治療和其他治療，且未患其他惡性腫瘤。

1.2 主要試劑與儀器磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、檸檬酸鹽抗原修復液購自河南賽諾特生物技術有限公司,Rab-3D兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司；免疫組織化學儀購自美國LEICA BOND-MAX公司,Leica組織切片機購自德國Leica公司,高速臺式離心機購自珠海黑馬有限公司,冷凍臺、BM-IX生物組織包埋機購自孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司,XK80-A快速混勻器購自江蘇新康醫(yī)療器械有限公司,TPJ-A型攤片機購自常州市中威電子儀器有限公司,光學顯微鏡購自日本尼康公司,pH測試儀購自上海秋騰貿(mào)易有限公司,大、中、小槍頭購自上海生工生物工程技術有限公司,低溫冰箱購自重慶飛瑞電器有限公司。

1.3 免疫組織化學法檢測各組織中Rab-3D表達取石蠟標本置于冰臺上冰凍后切片,厚度3～5 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；PBS沖洗3次，每次5 min；放入抗原修復液(pH=6.0)的檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原修復；PBS沖洗3次，每次 5 min；將切片放入體積分數(shù)3%的過氧化氫溶液中，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS 沖洗 3 次，每次 5 min；每張切片加 100 μL 的Ⅰ抗(Rab3D抗體濃度：1200)，并取 PBS 100 μL 代替Ⅰ抗作為陰性對照，將其置入濕盒內(nèi)，置于冰箱內(nèi)4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min；加生物素標記的抗兔二抗(濃度1200)，室溫孵育60 min；PBS沖洗3次，每次5 min；每張切片滴加鏈霉親和素-生物素-酶復合物；PBS沖洗3次，每次5 min；將切片放入3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色工作液中；PBS沖洗3次，每次5 min；流水沖洗，蘇木精復染后沖洗3次；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS替代一抗作為陰性對照，光學顯微鏡下觀察。

1.4 血清腫瘤標志物檢測采集患者術前清晨空腹靜脈血5 mL，4 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清CEA、CA19-9、CA242、CA155水平。CEA>5 μg·L-1、CA199>27 U·mL-1、CA242>20 KU·L-1、CA155>35 KU·L-1為陽性。

1.5 結(jié)果判定采取雙盲的方法，所有切片結(jié)果由3名病理科醫(yī)生分別獨立觀察評分，結(jié)果取均值。染色強度計分：無著色為1分，淡黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分,>75%為4分。最后將染色強度得分與陽性細胞百分比得分的乘積作為最終評分，總得分<6分為Rab-3D低表達，≥6分為Rab-3D高表達。

1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織中Rab-3D表達情況Rab-3D蛋白表達產(chǎn)物主要位于腫瘤細胞的細胞質(zhì)中，呈褐色深染，在癌旁組織及正常組織中細胞質(zhì)幾乎未見染色(圖1)。結(jié)直腸腺癌組織、癌旁組織和正常組織中Rab-3D高表達率分別為81.08%(60/74)、12.50%(5/40)和5.00%(2/40)；結(jié)直腸腺癌組織中Rab-3D的高表達率顯著高于癌旁組織及正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=49.381、60.584，P<0.05)；癌旁組織與正常組織中Rab-3D高表達率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.626，P>0.05)。

A：結(jié)直腸腺癌組織；B：癌旁組織；C：正常組織。

圖1 不同結(jié)直腸組織中Rab-3D表達(免疫組織化學染色,×100)

Fig.1 Expression of Rab-3D in different colorectal tissues(immunohistochemical,×100)

2.2 Rab-3D表達與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關系結(jié)果見表1。Rab-3D在結(jié)直腸腺癌組織中的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤組織分化、腫瘤大小無關(P>0.05),與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(P<0.05)。

表1 Rab-3D表達與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關系

Tab.1 Relationship between Rab-3D expression and clinicopathological features in patients with colorectal carcinoma

臨床特征nRab-3D低表達/例(%)高表達/例(%)χ2P性別 男384(10.53)34(89.47)3.5870.058 女3610(27.78)26(72.22)年齡 ≦60歲182(11.11)16(88.89)0.3920.531 >60歲5612(21.43)44(78.57)腫瘤部位 直腸389(23.68)29(76.32)1.1560.282 結(jié)腸365(13.89)31(86.11)腫瘤組織分化 高分化80(00.00)8(100.00) 中分化508(16.00)42(84.00)4.9420.084 低分化166(37.50)10(62.50)腫瘤大小 直徑≤5 cm429(21.43)33(78.57)0.3990.528 直徑>5 cm325(15.63)27(84.37)浸潤深度 T1～24713(27.66)34(72.34)6.4610.011 T3～4271(3.70)26(96.30)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是292(6.90)27(93.10)4.4930.034 否4512(26.67)33(73.33)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期4512(26.67)33(73.33)4.4930.034 Ⅲ+Ⅳ期292(6.90)27(93.10)

2.3 Rab-3D表達與結(jié)直腸腺癌患者血清腫瘤標志物的關系結(jié)果見表2。結(jié)直腸腺癌組織中Rab-3D表達與患者血清CEA水平有關(P<0.05)，與血清CA199、CA242、CA153水平無關(P>0.05)。

表2 Rab-3D表達與結(jié)直腸腺癌患者血清腫瘤標志物的關系

Tab.2 Relationship between Rab-3D expression and serum tumor markers in patients with colorectal cancer

腫瘤標志物nRab-3D低表達/例(%)高表達/例(%)χ2PCEA ≤5 μg·L-13411(32.35)23(67.65)7.4000.007 >5 μg·L-1403(7.50)37(92.50)CA19-9 ≤27 U·mL-1579(15.79)48(84.21)1.2280.268 >27 U·mL-1144(28.57)10(71.43)CA242 ≤20 KU·L-1456(13.33)39(86.67)2.8140.093 >20 KU·L-1183(16.67)15(83.33)CA155 ≤35 KU·L-1426(14.29)36(85.71)0.0100.922 >35 KU·L-1132(15.38)11(84.62)

3 討論

目前，Rab家族的幾個成員已經(jīng)被證明在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。例如Rab-22A對結(jié)直腸癌的增殖、轉(zhuǎn)移及化學治療敏感性均有影響[8]，Rab-27A和Rab-27B已被證明是結(jié)直腸癌患者轉(zhuǎn)移和預后的潛在預測因子[9-10]，Rab-40B是一種重要的蛋白質(zhì)分泌調(diào)節(jié)劑，在胃癌、乳腺癌等多種類型腫瘤中起著促癌作用[11-12]。在人類乳腺癌和肺癌預后較差的表型中發(fā)現(xiàn)了Rab-3D對侵襲性生長和轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用[13]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial mesenchymal transition,EMT)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著不可替代的作用[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，Rab-3D通過介導Akt/GSK3β/Snail途徑參與EMT的形成，故高表達的Rab-3D可能導致結(jié)直腸癌細胞的EMT過程[16]。YANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Rab-3D在惡性腫瘤組織中的表達較高，在正常組織及良性腫瘤中表達較低，且與腫瘤癌變過程及TNM分期密切相關，TNM分期越高，Rab-3D的表達越高；另外，從正常組織到腫瘤邊緣組織到腫瘤組織的變化過程中，Rab-3D蛋白的表達呈逐漸增高趨勢，提示Rab-3D在腫瘤發(fā)展中起重要的作用，是腫瘤進展過程中重要的因子,可作為腫瘤治療的靶點[17]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌組織中Rab-3D的高表達率顯著高于癌旁組織和正常組織，Rab-3D的高表達與結(jié)直腸腺癌腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關，提示Rab-3D在結(jié)直腸腺癌組織中的高表達與腫瘤的進展密切相關，Rab-3D可能具有致癌基因的某些特性，可促進腫瘤生長，加快腫瘤侵襲，可作為臨床上評估結(jié)直腸腺癌的候選腫瘤標志物，可作為轉(zhuǎn)移情況的預測指標之一。另外，Rab-3D的高表達還與腫瘤標志物血清CEA水平相關。研究表明，CEA是一種具有人類胚胎抗原特異性的酸性糖蛋白，定位于成熟腸細胞的根尖表面，在微絨毛的頂部，通過囊泡的運動使CEA“脫落”到排泄物中，而Rab-3D也參與調(diào)控真核細胞中囊泡介導的轉(zhuǎn)運[6]，故二者的表達水平可能通過囊泡的運動相互影響，具體蛋白通路有待進一步研究。以上研究結(jié)果提示，可將Rab-3D與血清CEA作為早期診斷結(jié)直腸腺癌的重要腫瘤標志物。

綜上所述，Rab-3D在結(jié)直腸腺癌中呈高表達，可作為診斷腫瘤的標志物，且Rab-3D高表達與結(jié)直腸腺癌患者腫瘤浸潤的深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及血清腫瘤標志物CEA水平相關，可作為預測結(jié)直腸癌腺患者病情進展的指標，對結(jié)直腸腺癌患者的診斷及預后有著重要的意義。