呂 旭，蘇 倩，劉曉磊，陸 靜，方 偉，王文龍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

家畜養(yǎng)殖過程中長(zhǎng)期不科學(xué)地濫用抗寄生蟲藥，使得全世界范圍的寄生蟲相繼出現(xiàn)抗藥性[1-2]，部分地區(qū)已經(jīng)嚴(yán)重到了無(wú)藥可用的地步，這些問題給畜牧業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，已成為世界性問題。對(duì)寄生蟲進(jìn)行耐藥性體外檢測(cè)是控制寄生蟲耐藥性產(chǎn)生的重要手段之一。而蟲卵孵化試驗(yàn)[3]（egg hatch assays，EHAs）、幼蟲麻痹移行活力測(cè)試[4]、幼蟲發(fā)育試驗(yàn)[5]、靜止期幼蟲形態(tài)分析[6]、幼蟲采食抑制試驗(yàn)[7]、寄生蟲基因組學(xué)研究[8]和分子生物學(xué)研究[9]等都需要孵化幼蟲，因此糞便中的蟲卵孵化率是決定這些試驗(yàn)或研究成敗的重要因素。這些體外試驗(yàn)或研究大都需要新鮮糞便樣品，這給樣品采集帶來(lái)不便，因而新鮮糞便樣品的保存、留樣顯得尤為重要。目前，糞便樣品的長(zhǎng)時(shí)間保存是否會(huì)影響到后續(xù)的試驗(yàn)或研究進(jìn)程鮮有報(bào)道?；谶@個(gè)因素，現(xiàn)將4 ℃無(wú)氧環(huán)境下，糞便保存時(shí)間對(duì)蟲卵孵化率的影響作一系統(tǒng)分析，旨在選擇一個(gè)較為理想的糞便保存時(shí)間，為綿羊消化道線蟲的耐藥性試驗(yàn)或研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

內(nèi)蒙古烏蘭察布市察哈爾右翼后旗某羊舍蟲卵數(shù)（EPG）≥10 000 的綿羊新鮮糞便，以及飽和食鹽水、生理鹽水、1640 培養(yǎng)液、PBS 緩沖液（含有250 mg/L的兩性霉素B和10 mL/L的青鏈霉素）、24 孔培養(yǎng)板、倒置顯微鏡、溫箱、離心機(jī)、真空封口機(jī)等。

1.2 糞便保存

將采集的新鮮綿羊顆粒狀糞便裝入真空袋（70 mm×100 mm），10 g/組，用真空封口機(jī)將真空袋密封，放入4 ℃冰箱。野外環(huán)境下，及時(shí)將采集的新鮮糞便放入含有冰袋的保溫箱中，并盡快放入4 ℃冰箱。

1.3 蟲卵收集

參考世界獸醫(yī)寄生蟲學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì)（WAAVP）推薦的蟲卵孵化試驗(yàn)EHAs 方法[10-11]，并對(duì)蟲卵提取系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，收集線蟲卵，制備蟲卵混懸液。取10 g 4 ℃無(wú)氧環(huán)境保存的綿羊糞便，加入50 mL 自來(lái)水充分?jǐn)嚢鑲溆?；?00、145、20 μm 3 種銅篩，從上至下依次疊放，把攪拌好的糞汁倒入500 μm 銅篩并平鋪開，等待5 min；用生理鹽水沖洗20 μm 銅篩中的沉積物，將沉積物用吸管吸入50 mL 離心管，3 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液；加入飽和食鹽水混合均勻，3 000 r/min 離心3 min，收集上清液；將上清液傾入20 μm 銅篩中，用生理鹽水沖洗10～20 s，然后再次用吸管吸入50 mL 于離心管中，3 000 r/min 離心5 min；棄掉上清液，加入PBS 緩沖液稀釋，得到每1 mL 含有（170±20）個(gè)蟲卵的混懸液，備用。蟲卵混懸液在每次蟲卵孵化前現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 蟲卵孵化

采用24 孔培養(yǎng)板，孔內(nèi)加入1 mL 含有（170±20）個(gè)蟲卵的混懸液和1 mL 1640 培養(yǎng)液，每次試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)重復(fù)，用封口膜密封，27 ℃孵育48 h；取出24 孔培養(yǎng)板，加入2 滴Lugol's 液終止孵化，在顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)孔中幼蟲和蟲卵的具體數(shù)量；取6 孔數(shù)據(jù)平均值，并計(jì)算蟲卵孵化率。自糞便采集日起，分別在采集后0、3、6、9、12、15、18 和21 d 重復(fù)進(jìn)行蟲卵孵化試驗(yàn)，共進(jìn)行8 次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Microsoft Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并取每次試驗(yàn)的平均值繪制折線統(tǒng)計(jì)圖。蟲卵孵化率=[平均幼蟲數(shù)/（平均幼蟲數(shù)+平均蟲卵數(shù)）]×100%

2 結(jié)果與分析

結(jié)果顯示，4 ℃無(wú)氧環(huán)境下，綿羊糞便在保存0、3、6、9、12、15、18 和21 d 的蟲卵孵化率 分 別 為90.07%、78.85%、67.02%、50.51%、22.18%、9.21%、9.94%和9.68%（表1）。

表1 4 ℃無(wú)氧環(huán)境保存不同時(shí)間的蟲卵孵化情況統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)分析顯示，糞便中的線蟲卵在采集當(dāng)天孵化率達(dá)到90%以上，但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲卵孵化率逐漸降低，其中保存9 d 內(nèi)的蟲卵孵化率下降較平緩，9 d 時(shí)仍有50.51%的蟲卵能夠得到良好的孵化，但9 d 后的蟲卵孵化率急劇下降至22.18%，15 d 后孵化的幼蟲數(shù)極少，孵化率無(wú)明顯變化。

3 討論

新鮮綿羊糞便的低溫?zé)o氧保存限制了糞便中線蟲卵發(fā)育所需的適宜條件，使蟲卵啟動(dòng)自身保護(hù)機(jī)制而停止發(fā)育，從而有效抑制了糞便保存過程中蟲卵發(fā)育成幼蟲。由于EHAs 等寄生蟲耐藥性體外檢測(cè)方法均需要未發(fā)育的蟲卵[10]，只能使用新鮮糞便或一定時(shí)限的低溫?zé)o氧保存糞便。但低溫?zé)o氧保存時(shí)限過長(zhǎng)，也會(huì)影響這些方法的準(zhǔn)確性和適用范圍，若時(shí)限過長(zhǎng)，糞便中的蟲卵會(huì)發(fā)育，就可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。之前有研究人員報(bào)道，新鮮糞便放入4 ℃無(wú)氧環(huán)境中可保存3 d。本研究發(fā)現(xiàn)，4 ℃無(wú)氧保存線蟲卵9 d 后，仍有50%以上的蟲卵可用于試驗(yàn)，這極大擴(kuò)展了EHAs 等試驗(yàn)的適用范圍，尤其是對(duì)需要在農(nóng)區(qū)、牧區(qū)、野外等環(huán)境下采集糞便的試驗(yàn)，以及采集成本高、過程困難的試驗(yàn)具有極大幫助。

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)氧含量是否對(duì)糞便中線蟲卵發(fā)育有影響的研究較少，對(duì)低溫條件是否會(huì)抑制蟲卵發(fā)育的研究較多。WAAVP 報(bào)道，有研究人員將蟲卵厭氧保存方法成功應(yīng)用于捻轉(zhuǎn)血矛線線蟲、蛇形毛圓線蟲、奧氏奧斯特線蟲等[11]。Bevevridge等[12]在4～10 ℃條件下研究了澳大利亞東部的糞便毛圓線蟲卵孵化率是否會(huì)受低溫影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫降低了蛇形毛圓線蟲等蟲卵的孵化率，但對(duì)透明毛圓線蟲卵的孵化率幾乎沒有影響。陳能橋等[13]在貴州遵義市研究了牛羊消化道線蟲卵在-3～3 ℃環(huán)境下是否會(huì)影響發(fā)育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫對(duì)毛圓線蟲、捻轉(zhuǎn)血毛線蟲、古柏線蟲、食道口線蟲的蟲卵影響較大，在-3～3 ℃環(huán)境保存72 h后，有94%的蟲卵變性死亡。

不同的溫度和保存時(shí)限影響消化道線蟲卵的孵化率，這與蟲卵地理分布、種屬差異等有一定的關(guān)系[12，14-15]。如貴州遵義市冬季平均氣溫3 ℃，內(nèi)蒙古烏蘭察布察哈爾右翼后旗冬季平均氣溫-15.7 ℃，兩地線蟲卵由于地理分布不同，通過長(zhǎng)期的蟲卵或幼蟲越冬淘汰，后者在4 ℃環(huán)境下的生存能力強(qiáng)于前者，因而保存時(shí)限也會(huì)所不同。低溫環(huán)境會(huì)對(duì)線蟲卵孵化形成一定的影響，因此低溫?zé)o氧保存的糞便樣品一般不適用于蟲種鑒定，如4 ℃保存可能影響捻轉(zhuǎn)血毛線蟲的孵化[16]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，4 ℃無(wú)氧保存新鮮綿羊糞便最長(zhǎng)時(shí)限為9 d，之后蟲卵大量死亡，無(wú)法達(dá)到長(zhǎng)期保存、留樣的目的。這可能是因?yàn)橄x卵長(zhǎng)時(shí)間處于低溫、無(wú)氧環(huán)境中，蟲卵自身營(yíng)養(yǎng)逐漸消耗，保存糞便用的真空袋殘留的微量氧氣也消耗殆盡，致使大部分蟲卵死亡。但9 d 后導(dǎo)致蟲卵孵化率迅速降低的具體因素，是蟲卵本身的原因，還是保存條件對(duì)其產(chǎn)生了不利影響，有待今后進(jìn)一步研究。