張鐵 祝超 葉瑩 雷軍 代春初 胡麗 司旭 張旗* 閆飛飛 蔡林

在全球范圍內(nèi)，骨移植是僅次于輸血的第二大組織移植。目前，用于治療骨缺損的3 種材料主要是自體骨、同種異體骨以及人工骨[1-6]。其中，自體骨始終作為骨移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”，治療效果最好，但是手術(shù)過程較為復(fù)雜，需要從患者身體取骨，導(dǎo)致術(shù)后疼痛和并發(fā)癥[1-5]。同種異體骨，如脫鈣骨基質(zhì)（decalcified bone matrix，DBM），其天然微孔結(jié)構(gòu)有利于傳導(dǎo)成骨，同時富含活性成骨因子而具有誘導(dǎo)成骨能力，能夠促進成骨細胞生長，但是材料來源單一，產(chǎn)品易漂移、不方便手術(shù)操作和植入部位的維持，且單獨的DBM不能用于微創(chuàng)注射[1-3,7]。所以相對于自體骨和同種異體骨，人工骨具有來源廣泛、產(chǎn)品多樣化的優(yōu)勢。其中，骨水泥產(chǎn)品由于其良好的加工性能，能原位固化而被廣泛研究和應(yīng)用。

硫酸鈣作為一種傳統(tǒng)的骨修復(fù)材料，因具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性而被廣泛研究，且在臨床上取得較優(yōu)異的成果[8-12]。但是，硫酸鈣骨水泥同時也存在可注射時間較短、降解時間過快、缺乏骨誘導(dǎo)活性等缺點，導(dǎo)致植骨區(qū)未愈合時材料已經(jīng)完全降解。磷酸鈣具有良好的生物活性、生物相容性和可注射性，能夠提供人體成骨所需的鈣離子和磷酸根離子；但是磷酸鈣類骨水泥可降解性能差，阻礙骨組織的生長[13-16]。單一材料制備的人工骨由于自身材料的缺陷，往往難以滿足多方面的要求。所以，選用兩種或者兩種以上材料，綜合各材料的優(yōu)勢，避免材料的缺點，共同達到臨床上各方面的要求就顯得尤為重要。

由此，本研究項目將硫酸鈣、磷酸鈣和羥丙甲纖維素（hypromellose，HPMC）作為固相原料，磷酸鹽溶液為液相，制備了一種雙相骨水泥，該骨水泥避免了硫酸鈣降解過快和磷酸鈣降解過慢的缺點，可與DBM 粉調(diào)和為可注射型植骨材料，解決了DBM 粉的植入操作性問題，同時DBM 的良好的誘導(dǎo)成骨能力促進了骨水泥的成骨效果。本文對該骨水泥的降解性能、力學(xué)性能、抗?jié)⑸⑿阅芗拔⒂^結(jié)構(gòu)進行了研究，并與DBM 復(fù)配使用，評估其成骨性能。

1 材料與方法

1.1 雙相骨水泥的制備

骨水泥由固相和液相組成，固相為硫酸鈣、磷酸鈣及羥丙甲纖維素（HPMC）為主的混合粉末，液相為磷酸鹽溶液。

固相制備：將硫酸鈣（醫(yī)藥級，湖南爾康制藥股份有限公司）、磷酸鈣（醫(yī)藥級，昆山華僑新材料科技有限公司）及HPMC（醫(yī)藥級，浙江中維藥業(yè)股份有限公司）通過球磨機在（350±10）r/min的條件下球磨，球磨時間10 ～30 min。

1.2 脫鈣骨基質(zhì)（DBM）的制備

選用200 ～300 g 雄性SD 大鼠50 只（武漢大學(xué)動物實驗中心提供），麻醉處死后取長管骨段壓碎后用手工磨粉器將其制作成骨粉，用分析篩篩選100 ～900 m 的骨粉備用。在10℃～12℃條件下，用乙醇復(fù)合溶劑進行脫脂，磁力攪拌24 h，用純化水進行反復(fù)震蕩沖洗40 min。用0.6 mol/L的鹽酸對骨粉進行脫鈣，磁力攪拌器持續(xù)攪拌24 h，更換鹽酸溶液后再脫鈣24 h。用純化水反復(fù)沖洗骨粉1 h。將所有骨粉同時進行冷凍干燥24 h。本實驗得到武漢大學(xué)中南醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 可注射時間、可注射性能和抗?jié)⑸⑿阅?/h3>

1.3.1 可注射時間

可注射時間能夠有效評價骨水泥是否方便于臨床操作。在溫度為（27±2）℃的環(huán)境下，將2.0 g 固相與0.8 mL 液相混合后轉(zhuǎn)移到2.5 mL 的注射器中，推擠出前段空氣，并塞緊錐頭帽。以開始混合為初始時間，20 min 后將錐頭帽取下，將注射器安裝到萬能材料試驗機上，垂直固定，錐頭向下，以30 mm/min 的推動速度測量推擠出來所需要的壓力（推擠力），運行時間為25 ～30 s。若推擠力大于100 N，則可注射時間小于20 min；若推擠力小于100 N，則可注射時間大于20 min。實驗重復(fù)3 次。

1.3.2 可注射性能

在溫度為（27±2）℃的環(huán)境下，將2.0 g 固相與0.8 mL液相混合后轉(zhuǎn)移到2.5 mL 的注射器中，推擠出前段空氣，將注射器安裝到萬能材料試驗機上，垂直固定，錐頭向下，加載100 N 恒定壓力，以10 mm/min 的推動速度向下擠出骨水泥，骨水泥的總重量為M，擠出后，剩余骨水泥的重量為M1，利用公式（1）計算雙相骨水泥的可注射性，重復(fù)5 次，計算算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.3 抗?jié)⑸⑿阅?/p>

將裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中放入恒溫恒濕箱中，調(diào)節(jié)參數(shù)：溫度37℃，濕度＞90%，待參數(shù)穩(wěn)定半小時后，將剛混合好的骨水泥轉(zhuǎn)移到2.5 mL 的注射器中，注射到培養(yǎng)皿中，觀察0 h 和24 h 的形態(tài)，重復(fù)3 次。

1.4 雙相骨水泥體外降解性能及理化性能

將雙相骨水泥混合成泥狀，放入到模具（內(nèi)孔=6 mm，h=12 mm）中成型，然后轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕箱（溫度37℃，濕度98%）中固化12 h，固化后將樣品取出，在烘箱（50℃）中干燥，直至樣品間隔0.5 h 稱量質(zhì)量差小于1%，記錄質(zhì)量，然后分別將樣品放到5 mL 的生理鹽水中，將所有樣品放置到37℃環(huán)境中，樣品分別放置3 d、5 d、14 d、28 d、56 d 后取樣，每次取6 個樣品進行觀察。每周更換生理鹽水，樣品從生理鹽水中取出后，烘干，測量其質(zhì)量后，利用萬能材料試驗機（Instron 5967，中國）測量抗壓強度，探頭加載速度為0.5 mm/min，并通過掃描電子顯微鏡（JSMIT300，日本）和X 射線衍射儀（D8 Advance，中國）對破損樣品分別進行截面分析和物相分析。

1.5 成骨性能預(yù)評估

本試驗僅用于初期評估雙相骨水泥與DBM復(fù)配使用的成骨性能。

1.5.1 動物模型的制作與分組

雙相骨水泥和DBM 經(jīng)Co60 滅菌（16 ～20 kGy），通過攪拌工具將骨水泥與40wt%DBM 混合，轉(zhuǎn)移到模具中（內(nèi)孔=6 mm，h=1.5 mm）成型后用。

健康8 周雄性Sprague-Dawly 大鼠12 只（武漢大學(xué)動物實驗中心提供），體重160 ～200 g。實驗組：手術(shù)前進行腹腔麻醉，大鼠頭部剃毛后常規(guī)消毒鋪巾，在無菌條件下切開皮膚，切口長約1.5 cm，使用磨骨鉆造孔（ 6 mm），植入樣本材料，縫合筋膜皮膚，放回籠內(nèi)分開養(yǎng)殖，動物蘇醒后自由活動，正常喂食。術(shù)后6 周、8 周和15 周處死動物，每次3 只，取植入物及其周圍的骨組織?？瞻捉M：造孔后不植入材料，其他步驟相同，術(shù)后6 周處死觀察。

CS/TCP 組：健康8 周雄性Sprague-Dawly 大鼠5 只（武漢大學(xué)動物實驗中心提供），體重160 ～200 g。造孔后植入雙相骨水泥，其他步驟相同，術(shù)后12 周處死觀察。相關(guān)數(shù)據(jù)由武漢大學(xué)中南醫(yī)院提供。

1.5.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定后，常規(guī)脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片，常規(guī)行HE 染色，觀察組織學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，抗壓強度和降解質(zhì)量比以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示?？箟簭姸缺容^采用 檢驗＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 可注射時間、可注射性能和抗?jié)⑸⑿阅?/h3>

該雙相骨水泥可注射時間＞20 min；固相與液相混合轉(zhuǎn)移到注射器中后立即注射，或20 min后，可注射性能均＞90%，除了部分殘留在錐頭中的骨水泥無法注射干凈，其他全部擠出，具有理想的可注射性能。與脫鈣骨基質(zhì)（DBM）復(fù)配使用后，能夠達到同樣的效果。

圖1 為骨水泥注射到生理鹽水中的形貌，從圖中看出，注射出的骨水泥表面光滑，形態(tài)均勻，無論是否添加DBM，該雙相骨水泥都能夠保持原狀，未發(fā)生潰散。且兩者注入到生理鹽水中60 min 后輕微振蕩，材料形態(tài)均未發(fā)生變化。

圖1 骨水泥注射到生理鹽水中的形貌：A.雙相骨水泥，0 h;B.雙相骨水泥，24 h;C.雙相骨水泥/DBM，0 h;D.雙相骨水泥/DBM，24 h

2.2 體外降解性能及理化性能

圖2 是雙相骨水泥在生理鹽水中抗壓強度和質(zhì)量隨時間的變化，具體數(shù)據(jù)陳列在表1 中，從圖2 和表1 中可以看出，隨著浸泡時間的延長，骨水泥呈下降趨勢，逐漸降解，但是抗壓強度先增加后減小，第5d 達到最大，為（21.4±3.1）MPa，56 d 時為（9.7±2.2）MPa。圖3 為雙相骨水泥在生理鹽水浸泡不同時間后的SEM 分析，從圖中看出，浸泡3 d 時，骨水泥空隙較少，隨著浸泡時間的延長，骨水泥的孔隙逐漸增加，在56 d 時，能夠觀察到分布均勻的空隙，空隙尺寸為0 ～150 m。圖4 為雙相骨水泥在生理鹽水浸泡不同時間后的XRD 分析，浸泡3 d 后，能夠明顯觀察到二水硫酸鈣、半水硫酸鈣（calcium sulfate hemihydrate, CSH）和缺鈣型羥基磷灰石（calcium deficient hydroxyapatite, CDHA）的特征峰，隨著浸泡時間的延長，CSH 的特征峰強度逐漸減弱，在56 d 時完全消失，且二水硫酸鈣的特征峰強度在56 d 時明顯降低，CDHA 的特征峰強度整個過程無明顯變化。

圖2 雙相骨水泥在生理鹽水中抗壓強度和質(zhì)量隨時間的變化

表1 雙相骨水泥在生理鹽水中浸泡不同時間的抗壓強度和質(zhì)量比

圖3 雙相骨水泥在生理鹽水浸泡不同時間后的SEM 分析（×200）：A.3 d;B.14 d;C.28 d;D.56 d

圖4 雙相骨水泥在生理鹽水浸泡不同時間后的XRD 分析

2.3 植入試驗

2.3.1 大體觀察

SD 大鼠均無死亡，活動、進食情況正常，精神狀態(tài)無明顯變化。未見癱瘓、驚厥、呼吸抑制等不良反應(yīng)。傷口均愈合良好。實驗組：取材后，6 周材料降解明顯，形態(tài)發(fā)生明顯改變，與周圍骨組織融合，但材料硬度較低；8 周時，材料變硬，顏色加深，難以與周圍骨組織區(qū)分；15 周時，植骨區(qū)域與周圍骨組織無區(qū)別。空白組：骨缺損區(qū)域未見明顯減小，無明顯成骨。CS/TCP 組：骨缺損區(qū)域減小，無明顯材料剩余。

2.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

HE 染色觀察植入雙相骨水泥/DBM 在不同時期的演變過程：術(shù)后6 周，無大片連續(xù)空白區(qū)域，表明骨水泥降解明顯，大量紅細胞和血管長入，存在形態(tài)完整的DBM 顆粒，且轉(zhuǎn)化為新骨，可見大量骨細胞，新骨被成骨細胞及間充質(zhì)細胞包繞，骨缺損中間和邊緣都可見明顯成骨（見圖5B）。術(shù)后8 周，空白區(qū)域進一步減少，表明材料被進一步吸收，成骨區(qū)域明顯增加，可見明顯骨髓，整個植骨區(qū)域基本被新骨和纖維組織替代（見圖5C）。術(shù)后15 周，成骨區(qū)域連成一片，與周圍骨組織完全連接，骨修復(fù)基本完成（見圖5D）。整個過程材料降解速度與成骨基本一致，成骨迅速，15 周骨修復(fù)基本完成。術(shù)后6 周，空白組骨缺損區(qū)域無明顯成骨，邊緣有少量新骨生成（見圖5A）。術(shù)后12 周，CS/TCP 組成骨區(qū)域僅限骨缺損邊緣區(qū)域，中間區(qū)域未見明顯成骨（見圖5E）。

圖5 SD 大鼠顱骨植入試驗HE 染色切片（×20）：A.空白組（術(shù)后6 周）;B.實驗組（術(shù)后6 周）;C.實驗組（術(shù)后8 周）;D.實驗組（術(shù)后15 周）;E.CS/TCP 組（術(shù)后12 周）

3 討論

骨水泥相對于其他植骨材料，主要優(yōu)勢在于能夠微創(chuàng)注射，減輕患者痛苦。可注射時間和可注射性能能夠有效表明該產(chǎn)品能否用于微創(chuàng)注射，可注射時間太短，產(chǎn)品易凝固在注射工具中，給患者帶來額外的傷害，可注射性能太差，產(chǎn)品殘留在注射工具中過多，增加患者費用。該雙相骨水泥混合均勻后即具有良好的注射性能，可注射時間＞20 min，可注射性能＞90%，且在1 h 內(nèi)具有一定程度的固化，能夠用于微創(chuàng)注射。

由于植骨區(qū)域存在一定的組織液，若產(chǎn)品的抗?jié)⑸⑿阅茌^差，產(chǎn)品會流失到其他部位，不利于骨組織的愈合。該雙相骨水泥初期主要通過羥丙甲纖維素良好的黏性起到抗?jié)⑸⒌淖饔?，后期骨水泥發(fā)生固化，形成整體，從而達到長時間不潰散的效果。

CSH 在生理鹽水中由于水化過程會轉(zhuǎn)變?yōu)镃SD，同時也會緩慢溶解，所以觀察到CSH 特征峰強度逐漸減弱，直至消失，而磷酸鈣水化后會生成羥基磷灰石。由于水化作用的存在，材料會逐漸形成只含有CSD 和CDHA 的雙相結(jié)構(gòu)，同時骨水泥的抗壓強度也會逐漸升高，但是由于硫酸鈣在不斷降解，形成孔隙，而水化過程逐漸減弱，最后骨水泥的抗壓強度逐漸降低。從SEM 分析可以看出，骨水泥的孔隙在不斷增加，最后形成多孔結(jié)構(gòu)。由于硫酸鈣降解較CDHA快，當(dāng)硫酸鈣完全降解后，骨水泥會形成只含有CDHA 的多孔結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)，多孔結(jié)構(gòu)的存在，有利于細胞的長入，起到骨傳導(dǎo)的作用。同時，在體內(nèi)細胞的吞噬作用會加速CDHA 的降解，釋放的鈣離子和磷酸根離子有利于骨愈合，使其逐漸被骨組織替代。

硫酸鈣和磷酸鈣植骨材料都具有良好的生物相容性，植入體內(nèi)后都能夠被人體吸收，逐漸被骨組織替代[3-6]。硫酸鈣在降解的過程中釋放大量的鈣離子，同時形成微酸環(huán)境，具有一定去礦化作用，促進周圍骨組織釋放BMP 等生長因子[8-11]；磷酸鈣降解過程中會釋放鈣離子和磷酸根離子，有助于類骨質(zhì)的鈣化，形成新骨。雙相骨水泥/DBM 植入體內(nèi)后，硫酸鈣會優(yōu)先降解，促使材料形成多孔結(jié)構(gòu)，有助于細胞的長入，促進內(nèi)部DBM 的降解。由于硫酸鈣6 ～8 周完全降解，而磷酸鈣降解較少，所以術(shù)后6 周，可明顯觀察到空白區(qū)域。同時觀察到DBM 降解，從而釋放BMP 等生長因子，誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化，所以雙相骨水泥/DBM 不僅具有骨傳導(dǎo)能力還有骨誘導(dǎo)能力，故而觀察到骨缺損的邊緣與中間區(qū)域同時成骨，加速骨愈合。術(shù)后8 周，成骨區(qū)域增加明顯。同時磷酸鈣降解較慢，能夠起到骨傳導(dǎo)和促進類骨質(zhì)鈣化的作用，持續(xù)促進成骨，術(shù)后15 周骨缺損基本愈合，僅少量磷酸鈣鹽未降解，可以觀察到小部分空白區(qū)域，后期可被骨組織完全替代。由于單獨的雙相骨水泥僅具有骨傳導(dǎo)能力，故而僅觀察到新骨沿邊緣逐漸向內(nèi)生長，中間區(qū)域沒有新骨形成，不能多區(qū)域同時成骨，從而不能多區(qū)域發(fā)生骨傳導(dǎo)作用，故而骨形成速度較雙相骨水泥/DBM 慢。

4 結(jié)論

本研究制備的雙相骨水泥具有良好的注射性能及降解性能，在生理鹽水中具有較好的抗?jié)⑸⑿阅?，長時間維持一定的力學(xué)強度。完全固化后會形成雙相結(jié)構(gòu)，使其在降解的過程中形成多孔結(jié)構(gòu)，加速剩余材料的降解。與DBM 復(fù)配使用后，同樣具有較好的注射性能和抗?jié)⑸⑿阅?，是DBM 實現(xiàn)微創(chuàng)注射的良好載體，植入SD 大鼠體內(nèi)，其降解速度與成骨速度基本一致，能夠快速成骨，術(shù)后15 周骨愈合基本完成，但還能觀察到少量磷酸鈣材料未降解。本文主要缺點在于動物數(shù)量較少，觀察指標(biāo)較少，有待進一步研究。