張兆霞，郭慧玲*，劉會(huì)香，崔玉國，申衛(wèi)星，王玉杰，陳 巖

（1.泰山森林病蟲害防治檢疫站，山東 泰安271000；2.泰山風(fēng)景名勝區(qū)管委會(huì)，山東 泰安 27100；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安271018）

湖北海棠（Malus hupehensis(Pamp.)Rehd..）位于泰山南天門海拔1300m以上，在天街至碧霞祠一帶成片分布，因?yàn)檫m應(yīng)泰山極頂?shù)牡乩須夂颦h(huán)境，湖北海棠常被稱作“泰山海棠”，是泰山高海拔地區(qū)特有的水土保持和景觀樹種。每年春季岱頂大片海棠綻開蓓蕾，連天開放，碧霞祠一帶像是成了花的海洋，秋季則紅果累累，掛滿枝頭。泰山現(xiàn)有海棠林大部分為上世紀(jì)60年代人工造林而成，由于林齡過熟和山頂特殊氣候原因，普遍存在生長(zhǎng)不良、樹勢(shì)衰弱，甚至出現(xiàn)樹木干枯死亡情況。對(duì)湖北海棠林分進(jìn)行有害生物種類調(diào)查的基礎(chǔ)上，確定湖北海棠生長(zhǎng)衰弱的原因主要是由于枝干潰瘍病的病菌侵染擴(kuò)散所致。本文野外采集湖北海棠枝干潰瘍病的病菌病斑進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)和分子鑒定，為下一步科學(xué)治理海棠潰瘍病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從野外發(fā)生枝干潰瘍病的湖北海棠樹上剪取若干病枝條。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病菌的分離方法

在實(shí)驗(yàn)室從海棠枝干病斑處切取大小約5mm病組織共15塊，采用常規(guī)組織分離法。先移置于PDA培養(yǎng)基平板放在25℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3天[5]。統(tǒng)計(jì)各菌株出現(xiàn)的概率，純化后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病菌培養(yǎng)

湖北海棠潰瘍病菌分離純化后在25℃培養(yǎng)5天后，觀察其菌落特征，用顯微鏡觀察病菌子實(shí)體大小、形態(tài)及孢子的形態(tài)。在菌絲體中鉆取5個(gè)菌餅，將菌接種到PD（液體馬鈴薯）培養(yǎng)基中，放置于28℃，200rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)兩天，于-20℃保存。

1.2.3 病菌DNA的提取

DNA的提取采用2×CTAB法，將培養(yǎng)好的菌絲烘干加入液氮冷凍研磨至細(xì)小粉末，取0.25g粉末加入預(yù)熱的2-ME/CTAB抽提液(1ml)中，65℃保溫45～60min，顛倒混勻，加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）溶液混勻，12000rpm/min 離心 30min，取上清加入 0.5～0.6（350uL）倍體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置20min；12000rpm/min離心10min；去上清夜，DNA沉淀以70%乙醇洗滌并干燥后溶于50ug/mL RNase的TE緩沖液，置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈笥?0g/l瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。

1.2.4 rDNA及ITS序列擴(kuò)增

利用真核生物的基因通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，引物序列為 ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和 ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR 總反應(yīng)體系為 25 ul，其中10×PCR Buffer為2.5ul，Mg2+1ul，dNTP 1ul,ITS1和 ITS4各為 2uL，Taq酶 0.5uL，ddH2O14ul，DNA模板2uL，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃，預(yù)變性3min后進(jìn)入以下循環(huán)：94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)后于72℃下10 min，并在4℃下保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行10g/l瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物純化及測(cè)序鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用Biospin膠DNA回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行純化擴(kuò)增并電泳。染色后在凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載公認(rèn)Botryosphaeria dothidea序列為參考，參比菌株具體信息為KT182890.1,FJ493245.1,KF294012.1,MH715242.1,JX241645.1與供試菌株相應(yīng)序列一起采用Mega5.1中ClustalW進(jìn)行比對(duì)并校正。輪紋病菌以Fusarium oxysporum(JK747249.1 4-C10)為外源，基因序列自展法（Bootstrap）檢測(cè)，重復(fù) 1000次，構(gòu)建鄰接樹（Neighbor-Joining Tree）。腐爛病菌以Botryosphaeria dothidea序列為外源，其他方法相同。

1.2.6 致病性測(cè)定

采用菌餅接種法[3]。選取PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5天的菌餅采取刺傷接種健康蘋果果實(shí)上，以不接種病菌的蘋果果實(shí)為對(duì)照，重復(fù)15次，5天后觀察接種結(jié)果。

1.2.7 病菌生理學(xué)特性研究

1.2.7.1 病菌對(duì)不同溫度的適應(yīng)性

將海棠輪紋病和腐爛病病菌分別接種于PDA培養(yǎng)基，打孔器內(nèi)徑為0.5mm，分別于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和 40℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天后測(cè)量菌落直徑，每個(gè)菌株重復(fù)3次。

1.2.7.2 病菌對(duì)不同pH的適應(yīng)性

將湖北海棠輪紋病菌接種于pH 為 3、4、5、6、7、8、9、10和 11的 PDA培養(yǎng)基上，打孔器內(nèi)徑為0.5mm，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天后測(cè)量菌落直徑，每個(gè)菌株重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.2 病原菌的分離

選取的15塊病組織經(jīng)分離純化共獲得15個(gè)菌株，放于25℃恒溫箱備用。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 培養(yǎng)學(xué)特性

2.3.1.1 海棠輪紋病菌培養(yǎng)學(xué)特性觀察

海棠輪紋病菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)初期菌落為白色，疏松，棉絮狀，氣生菌絲較發(fā)達(dá)，菌落邊緣整齊或不整齊。培養(yǎng)3d后，菌落逐漸變成灰色，10d左右，菌落呈深灰色至黑色。顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌絲初期無色，后為深褐色，菌絲粗細(xì)不勻，分枝發(fā)達(dá)，有隔（如圖1）。

圖1 海棠輪紋病菌的培養(yǎng)學(xué)特征（5d）

2.3.1.2 泰山海棠腐爛病菌培養(yǎng)學(xué)特性觀察

海棠腐爛病菌在PDA培養(yǎng)基上初為白色，后變?yōu)闇\黃色，菌絲匍匐，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，基內(nèi)生長(zhǎng)，菌落邊緣整體，3～5天長(zhǎng)滿整個(gè)平皿，此后菌絲繼續(xù)向培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，后期20天長(zhǎng)出褐色的分生孢子器或者直接溢出分生孢子堆（如圖2）。

圖2 海棠腐爛病菌的培養(yǎng)學(xué)特征（20d）

2.3.2 形態(tài)學(xué)特性

2.3.2.1 海棠輪紋病菌鏡檢形態(tài)學(xué)特性

解剖鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)，海棠輪紋病菌分生孢子器呈黑褐色，初埋生于寄主表皮下，后突破表皮部分外露。分生孢子多為單生，單腔室，扁球形或球形，有孔口，大小約 110.12～154.28μm ×82.74～150.23μm，平均 129.67～114.27μm。內(nèi)壁生分生孢子梗，孢子梗無色，不分支。分生孢子梭形，正直，無色，單孢，頂端鈍圓，基部平截，大小為16.83～24.55μm ×5.27～8.17μm，平均 18.35 ×6.34μm（如圖3）。

圖3 海棠輪紋病菌在解剖鏡下鏡檢形態(tài)特征

2.3.2.2 泰山海棠腐爛病菌鏡檢形態(tài)學(xué)特性

解剖鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)，腐爛病菌分生孢子器著生于外子座內(nèi)，扁瓶狀，480～1600μm× 400～960μm，多個(gè)腔室，相通，同一孔口，室壁密生分生孢子梗；分生孢子單孢，臘腸形或香蕉形，3.6～8.0μm×0.8～1.7μm。孢子溢出形成橘黃色孢子角（如圖4）。

圖4 海棠腐爛病菌形態(tài)特征

2.3.3 泰山潰瘍病病原菌的分子鑒定

2.3.3.1 泰山海棠輪紋病菌ITS序列測(cè)定及系統(tǒng)樹構(gòu)建

海棠輪紋病菌經(jīng)PCR檢測(cè)，其大小介于500-750bp之間，序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)海棠輪紋病菌的ITS序列長(zhǎng)583bp。經(jīng)Blast軟件分析對(duì)比，分子鑒定認(rèn)為泰山海棠輪紋病是子囊菌門(Ascomycotina)，葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），其系統(tǒng)樹構(gòu)建如圖5所示。

圖5 基于ITS基因序列的海棠輪紋病菌系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖5看出，所測(cè)定的序列確與Botryosphaeria dothidea真菌的系統(tǒng)發(fā)育最近，再結(jié)合病菌的培養(yǎng)學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，可以明確泰山海棠輪紋病菌為Botryosphaeria dothidea。

2.3.3.2 泰山海棠腐爛病菌ITS序列測(cè)定及系統(tǒng)樹構(gòu)建

海棠腐爛病菌系統(tǒng)樹構(gòu)建如圖6所示。

圖6 基于ITS基因序列的海棠腐爛病菌系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖6看出，海棠腐爛病菌經(jīng)過序列測(cè)定和系統(tǒng)樹構(gòu)建并結(jié)合病菌的培養(yǎng)學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，鑒定泰山海棠腐爛病是由Valsa ceratosperma真菌引起。

2.4 海棠潰瘍病病原菌的致病性測(cè)定

圖7 海棠輪紋病和腐爛病菌接種蘋果后的不同癥狀

室內(nèi)人工接種蘋果果實(shí)（如圖7）發(fā)現(xiàn)，分離的2種病原菌對(duì)蘋果果實(shí)均有致病性，其發(fā)病癥狀和蘋果輪紋病、腐爛病病癥表現(xiàn)一致。再次證明Botryosphaeria dothidea是泰山海棠輪紋病的病原菌；Valsa ceratosperma是泰山海棠腐爛病的病原菌。

2.5 病菌對(duì)溫度的適應(yīng)性

在不同溫度下的PDA培養(yǎng)基上，湖北海棠輪紋病菌和腐爛病菌的生長(zhǎng)特性如圖8和表1所示。

圖8 湖北海棠輪紋病菌在不同溫度下的生長(zhǎng)特性（3d）（從左到右從上到下依次是在 10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃輪紋病菌的生長(zhǎng)狀況）

表1 湖北海棠輪紋病菌和腐爛病菌不同溫度生長(zhǎng)情況/mm

由圖8和表1可以看出，泰山海棠輪紋病菌和腐爛病菌在10℃～35℃條件下均可生長(zhǎng)，隨著溫度的升高，兩種病菌的生長(zhǎng)速度加快，病菌在25℃生長(zhǎng)最好，其次是30℃、20℃和15℃，其他溫度下病菌的生長(zhǎng)速度明顯減慢，腐爛病菌的耐高溫能力稍強(qiáng)于輪紋病菌。對(duì)溫度的適應(yīng)性更強(qiáng)一些。

2.6 病菌對(duì)不同pH的適應(yīng)性

泰山海棠輪紋病菌和腐爛病菌在25℃下，不同pH的PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)結(jié)果見表2。由表4可知，不同pH條件下，海棠輪紋病菌和腐爛病菌生長(zhǎng)特征存在差異，海棠輪紋病菌的生長(zhǎng)范圍稍窄一些，在pH4～10之間；而海棠腐爛病菌在pH3～11之間均可生長(zhǎng)。隨著pH的升高，兩種病菌的生長(zhǎng)速度加快，其中腐爛病菌在pH6時(shí)生長(zhǎng)最快，輪紋病菌在pH5生長(zhǎng)最快，總體表現(xiàn)為輪紋病菌生長(zhǎng)稍慢于腐爛病菌生長(zhǎng)，說明海棠腐爛病菌對(duì)酸堿度的適應(yīng)性更強(qiáng)一些。

表2 湖北海棠輪紋病菌和腐爛病菌不同pH生長(zhǎng)情況/mm

3 結(jié)論與討論

通過海棠枝干潰瘍病原菌的培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子序列特征、系統(tǒng)樹構(gòu)建及致病性測(cè)定表明，海棠枝干潰瘍病主要由輪紋病和腐爛病兩種病害所致，鑒定病原菌2種，其中海棠輪紋病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）；海棠腐爛病原菌為 Valsa ceratosperma。生理學(xué)研究表明，兩種病菌對(duì)溫度和pH的要求均隨著溫度或者酸堿度提高而逐漸生長(zhǎng)加速，但不同病菌的適應(yīng)性不同，其中腐爛病菌對(duì)溫度和酸堿度的適應(yīng)性更強(qiáng)一些。2種病菌造成湖北海棠枝干潰瘍病的發(fā)生在國內(nèi)鮮有報(bào)道，尤其是大面積分布在泰山高海拔區(qū)1300m處的湖北海棠林分。本研究明確了湖北海棠枝干潰瘍病原菌發(fā)生的種類及致病病原菌，為下一步綜合治理湖北海棠枝干潰瘍病提供了理論支持。