李丹丹 張慧 李思雨 郭泰麟

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）23-3240-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.13

摘 要 目的：建立不同來(lái)源大黃藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并對(duì)其中差異成分進(jìn)行定性鑒別。方法：采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件建立30批大黃藥材（掌葉大黃20批、唐古特大黃和藥用大黃各5批）的HPLC指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，采用偏最小二乘判別法（PLS-DA）結(jié)合超高效液相色譜（UPLC）-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOF-MS）法定性鑒別3種來(lái)源大黃的差異性成分。結(jié)果：30批大黃藥材樣品指紋圖譜的相似度在0.609～0.960之間。經(jīng)PLS-DA分析，大黃藥材樣品按來(lái)源明顯聚集為3組，3組樣品間差異性成分共有18個(gè)，經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS鑒別為白藜蘆醇-4′-O-β-D-（6″-O-沒(méi)食子酰）-葡萄糖苷、蓮花掌苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、4-（4′-羥苯基）-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-肉桂?；?6″-O-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷等。結(jié)論：建立的方法可有效區(qū)分3種不同來(lái)源大黃藥材，并對(duì)其差異成分進(jìn)行鑒別，為多來(lái)源藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。

關(guān)鍵詞 大黃;指紋圖譜;高效液相色譜;超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間-串聯(lián)質(zhì)譜法;偏最小二乘判別法;差異成分

Study on Different Components of Rhei Radix Et Rhizoma from 3 Different Origins Based on HPLC Fingerprint and UPLC-Q-TOF-MS

LI Dandan，ZHANG Hui，LI Siyu，GUO Tailin（College of Pharmacy，Liaoning University of TCM，Liaoning Dalian 116600，China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of Rhei Radix Et Rhizoma from different origins， and identify the differential components qualitatively. METHODS： HPLC fingerprints of 30 batches of Rhei Radix Et Rhizoma （20 batches of Rheum palmatum， 5 batches of Rheum tanguticum and 5 batches of Rheum officinale） were established and similarity evaluation was performed by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition）. Qualitative identification of differential components of Rhei Radix Et Rhizoma from 3 different origins were performed by using PLS-DA combined with UPLC-Q-TOF-MS. RESULTS：The fingerprint similarities of 30 batches of samples were between 0.609 and 0.960. According to PLS-DA analysis， Rhei Radix Et Rhizoma were significantly aggregated into 3 groups according to the origin. There were 18 different components among 3 groups， which were identified by UPLC-Q-TOF-MS as resveratrol-4′-O-β-D-（6″-O-gallacyl）-glucoside， lindleyin， rhein-8-O-glucoside， epicatechin gallate， 4-（4′-hydroxyphenyl）-2-butanone-4′-O-β-D-（2″-O-cinnamyl-6″-O-gallacyl）-glucoside. CONCLUSIONS： Established method can effectively identify Rhei Radix Et Rhizoma from 3 different origins， and the differential components can be distinguished， which provides a reference for the identification and quality evaluation of multi-source medicinal materials.

KEYWORDS ? Rhei Radix Et Rhizoma; Fingerprint; HPLC; UPLC-Q-TOF-MS; PLS-DA; Differential component

大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)等功效[1]，是臨床常用中藥，且用藥歷史悠久。現(xiàn)今，在市場(chǎng)上流通的3種正品大黃藥材和飲片質(zhì)量參差不齊，行業(yè)內(nèi)公認(rèn)唐古特大黃和掌葉大黃為優(yōu)良品種[2]。但3者在外觀性狀上相似，通過(guò)性狀難以實(shí)現(xiàn)有效區(qū)分，因此市場(chǎng)上常見大黃品種來(lái)源混淆的現(xiàn)象[3]。為此，亟需建立區(qū)分3種來(lái)源大黃的鑒別方法，同時(shí)尋找出3種大黃的差異性成分，以控制大黃藥材的質(zhì)量。目前，雖有大黃藥材指紋圖譜以及3種大黃藥材預(yù)測(cè)模型構(gòu)建等方面的研究[4-5]，但3種來(lái)源大黃的差異性成分仍不清楚?；诖耍狙芯拷Y(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法[偏最小二乘判別法（PLS-DA法）]，對(duì)3種不同來(lái)源大黃的全成分指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出差異成分峰，并利用超高效液相色譜（UPLC）-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOF-MS）法對(duì)差異成分峰進(jìn)行定性識(shí)別，從而明確并識(shí)別3種來(lái)源大黃的差異成分，為大黃藥材的質(zhì)量控制和綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CP225D電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;KQ-250D數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;FW-80小型中藥高速粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）;TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）;6550 Q-TOF-MS儀、1260高效液相色譜儀、1290 UPLC儀、G4212B 1260二極管陣列檢測(cè)器（DAD）（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 藥品與試劑

30批藥材收集于四川、甘肅、青海等省，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張慧教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃（R. palmatum L.）、唐古特大黃（R. tangguticum Maxim.ex Balf.）和藥用大黃（R. officinale Balf.）的干燥根和根莖;蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：CHB190115，純度：≥98%）、大黃酚-8-O-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：CHB180726，純度：≥98%）、大黃素-8-O-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：CHB180727，純度：≥98%）、大黃酸-8-O-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：CHB180726，純度：≥98%）、番瀉苷A對(duì)照品（批號(hào)：CHB180729，純度：≥98%）均由成都克洛瑪生物科技有限公司提供;沒(méi)食子酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y19M8C36143，純度：≥98%）;大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110，純度：≥98.6%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201013，純度：≥99.8%）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-200206，純度：≥99.8%）、蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795- 200806，純度：≥98.6%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;甲醇、甲酸為色譜純，水為純凈水。大黃樣品來(lái)源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.4%甲酸水（B），梯度洗脫（0～8 min，5%→30%A;8～15 min，30%→33%A;15～25 min，33%→35%A;25～30 min，35%→37%A;30～35 min，37%→40%A;35～47 min，40%→45%A;47～64 min，45%→50%A;64～80 min，50%→55%A;80～83 min，55%→60%A;83～93 min，60%→100%A）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

將大黃藥材粉碎過(guò)80目篩，取粉末0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，室溫超聲（頻率：40 kHz，功率：200 W）30 min，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心 （4 000 ? r/min） 5 min，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 對(duì)照品貯備液的制備

精密稱取沒(méi)食子酸、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品適量，分別置于不同的10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成質(zhì)量濃度分別為0.146、0.600、0.506、0.556、0.600、0.407、0.130、0.353、0.103、1.066 ? ?mg/mL的對(duì)照品貯備液，4 ℃保存，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取S9號(hào)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以峰4（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷峰）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9號(hào)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫放置0、3、6、9、12、24 h后，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰4（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%（n=6），表明樣品在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S9號(hào)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每份樣品進(jìn)樣2次，記錄色譜圖。以峰4（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 30批大黃指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備30批大黃的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件對(duì)30批大黃的HPLC圖譜進(jìn)行分析。以S1號(hào)圖譜作為參照?qǐng)D譜（S1號(hào)圖譜中各峰信號(hào)強(qiáng)度大、分離完全），設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，通過(guò)多點(diǎn)校正及自動(dòng)匹配生成30批大黃樣品的共有模式，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜R，并以生成的對(duì)照?qǐng)D譜R為參照進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，共標(biāo)定出了21個(gè)共有峰。以峰4（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷）作為參照峰（S）計(jì)算得到的30批大黃樣品中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1.78%（n=30），重現(xiàn)性較好;但其相對(duì)峰面積的RSD在31.76%～153.20%之間（n=30），波動(dòng)較大，這表明不同來(lái)源大黃樣品中共有成分的含量差異較大。相似度分析結(jié)果顯示，各指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度在0.609～0.960之間，其中掌葉大黃的相似度在0.778～0.960之間，藥用大黃的相似度在0.745～0.792之間，唐古特大黃的相似度在0.609～0.690之間。30批大黃藥材指紋圖譜的共有模式、對(duì)照?qǐng)D譜R見圖1，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積分別見表2、表3，相似度分析結(jié)果見表4。

2.4.2 3種不同來(lái)源大黃對(duì)照?qǐng)D譜的建立及特征成分差異峰的分析 按“2.4.1”項(xiàng)下指紋圖譜生成方法，分別得到20批掌葉大黃、5批藥用大黃和5批唐古特大黃樣品的指紋圖譜，并得到其相應(yīng)的對(duì)照?qǐng)D譜。結(jié)果顯示，3種來(lái)源大黃的對(duì)照?qǐng)D譜中共有峰在數(shù)量和含量上均存在一定的差異，掌葉大黃對(duì)照?qǐng)D譜中標(biāo)定的共有峰為21個(gè)，藥用大黃對(duì)照?qǐng)D譜中標(biāo)定的共有峰為24個(gè)，而唐古特大黃對(duì)照?qǐng)D譜中標(biāo)定的共有峰為30個(gè)。與掌葉大黃對(duì)照?qǐng)D譜相比，藥用大黃對(duì)照?qǐng)D譜上增加了22～24號(hào)3個(gè)特征峰，唐古特大黃對(duì)照?qǐng)D譜上增加了22號(hào)和24～31號(hào)共9個(gè)特征峰。3種不同來(lái)源大黃的對(duì)照?qǐng)D譜見圖2。

2.4.3 共有峰和特征成分差異峰的鑒定 分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備3種不同來(lái)源大黃樣品（S9、S23、S28）的供試品溶液，并取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析。色譜條件同“2.1”項(xiàng)下。MS條件為采用Dual AJS 電噴霧離子源（ESI），在負(fù)離子下模式檢測(cè);干燥氣溫度為200 ℃，干燥氣流速為14 L/min;霧化氣壓為35 psi;鞘氣溫度為400 ℃，鞘氣流速為11 L/min;毛細(xì)管電壓為3 500 V;母離子掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～1 700;二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描范圍為m/z 100～1 000;碰撞能量為-30 eV。結(jié)合對(duì)照品圖譜、樣品質(zhì)譜裂解信息以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[6-8]，初步鑒定了21個(gè)共有成分峰和“2.4.2”中確定的3種大黃指紋圖譜之間的10個(gè)特征差異成分峰。其中，21個(gè)共有成分多為結(jié)合蒽醌、游離蒽醌及蒽酮類成分，藥用大黃區(qū)別于掌葉大黃的特征成分（22～24號(hào)峰）為鞣質(zhì)和蒽酮類成分，而唐古特大黃區(qū)別于其他兩種來(lái)源大黃的特征成分（25～31號(hào)峰）包含了鞣質(zhì)、苯丁酮苷和二苯乙烯類成分。3種不同來(lái)源大黃化學(xué)成分MS鑒定結(jié)果見表5。

2.4.4 PLS-DA法分析差異性成分 PLS-DA是一種集主成分分析（PCA）、典型相關(guān)分析（CCA）和多元回歸分析的基本功能為一體的具有監(jiān)督模式的識(shí)別方法，可以消除眾多化學(xué)信息中相互重疊的部分，使分析數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確可靠[9]。以鑒定出的30批大黃樣品的21個(gè)共有峰和10個(gè)特征差異成分峰的峰面積為變量，將其導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件中進(jìn)行PLS-DA分析，獲取PLS-DA得分圖[PLS-DA模型中，當(dāng)R2Y（累積解釋能力參數(shù)）、Q2（模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)）均大于0.5時(shí)，可認(rèn)為該模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力較好]和變量權(quán)重重要性排序（VIP）圖（當(dāng)VIP>1時(shí)，表明該成分是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物）[10-11]。結(jié)果顯示，建立的PLS-DA模型中R2Y和Q2分別為0.886和0.859，表明該模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力較好，可用于鑒別和區(qū)分3種來(lái)源大黃樣品。根據(jù)PLS-DA得分圖可知，大黃樣品按來(lái)源可區(qū)分為3組，能直觀顯示出各組間的差異。根據(jù)VIP圖可知，共有18個(gè)峰的VIP>1，按權(quán)重重要性排序依次為峰29>峰28>峰5>峰27>峰31>峰24>峰9>峰22>峰14>峰2>峰13>峰4>峰17>峰3>峰8>峰15>峰10>峰26，即篩選出的差異性成分分別是白藜蘆醇-4′-O-β-D-（6″-O-沒(méi)食子酰）-葡萄糖苷、蓮花掌苷、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、4-（4′-羥苯基）-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-肉桂?；?6″-O-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷、決明柯酮-O-乙?；?葡萄糖苷、決明柯酮-8-O-葡萄糖苷、沒(méi)食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-O-丙二?；?葡萄糖苷、兒茶素、大黃素-8-O-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-O-乙?；?葡萄糖苷、異蓮花掌苷、番瀉苷A、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-1-O-葡萄糖苷和沒(méi)食子酸-O-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷。PLS-DA得分圖和VIP得分圖分別見圖3、圖4。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在前期預(yù)試驗(yàn)中，筆者分別對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相、柱溫等色譜條件進(jìn)行了篩選：（1）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]，大黃中蒽醌類成分多在254、280 和430 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，故本研究分別考察了在254、280、430 nm波長(zhǎng)處大黃樣品的色譜行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)在254 nm時(shí)色譜峰數(shù)較多、基線最平穩(wěn)、峰形較好，故本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)最終確定為254 nm。（2）流動(dòng)相的選擇。筆者前期分別比較了以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-0.4%甲酸水為流動(dòng)相體系的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.4%甲酸水為流動(dòng)相時(shí)，所得色譜圖基線更平穩(wěn)，故本研究流動(dòng)相體系選擇甲醇-0.4%甲酸水溶液。（3）柱溫的選擇。筆者前期分別考察了25、30、35 ℃柱溫對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果柱溫為30 ℃時(shí)峰形最佳且分離度良好，故本研究中柱溫選擇30 ℃。

3.2 樣品提取條件的考察

筆者在前期分別比較了不同提取溶劑（甲醇、75%甲醇、乙醇、75%乙醇）、不同提取方法（超聲、回流）以及不同提取時(shí)間（10、30、60 min）對(duì)樣品的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以甲醇作為提取溶劑時(shí)提取得到的各成分含量最高;樣品經(jīng)回流和超聲提取后色譜峰種類和面積均無(wú)明顯差異;在30 min提取效果最佳。為使試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，故選擇以甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min的方式進(jìn)行樣品處理。

3.3 大黃藥材差異成分的比較分析

據(jù)30批大黃藥材相似度分析結(jié)果顯示：僅S2、S4、S15和S19樣品的相似度達(dá)到0.9以上，其均為掌葉大黃;而藥用大黃與唐古特大黃的相似度較差，均低于0.8。通過(guò)比較3種來(lái)源大黃的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，唐古特大黃和藥用大黃的共有峰數(shù)量較多，且鞣質(zhì)類和結(jié)合蒽醌類成分顯著高于掌葉大黃（峰面積較大），而掌葉大黃中的游離蒽醌類成分含量顯著高于其他2種來(lái)源大黃（16，18～21號(hào)峰面積明顯較大）。PLS-DA分析將30批大黃分為3組，該分類趨勢(shì)可能與其來(lái)源、生長(zhǎng)年限、生態(tài)環(huán)境具有一定的相關(guān)性，但不絕對(duì)相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)PLS-DA模型中的VIP排序篩選出可區(qū)分不同來(lái)源大黃的18個(gè)差異性成分，這些成分可以作為快速區(qū)分不同來(lái)源大黃藥材的指標(biāo)，這為大黃的質(zhì)量評(píng)價(jià)以及多來(lái)源藥材的質(zhì)量控制提供了參考。

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（收稿日期：2019-07-18 修回日期：2019-09-06）

（編輯：林 靜）