李滿香 張進(jìn)芳 陳偉 王黔陽(yáng) 康冀川 何珺

摘 要：探究大孔吸附樹脂富集純化番瀉豆莢中番瀉苷的最佳工藝。以番瀉豆莢為原料，采用高效液相測(cè)定番瀉苷A、B含量，以吸附率及解吸率為指標(biāo)，采用靜態(tài)吸附試驗(yàn)對(duì)5種大孔樹脂進(jìn)行篩選，優(yōu)選出吸附解吸性能最佳的大孔樹脂，并對(duì)純化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：AB-8型樹脂對(duì)番瀉豆莢中番瀉苷有較好的吸附及解吸附效果，其最佳工藝為：樹脂飽和吸附量按生藥計(jì)為0.21 g/g，徑高比為1∶8，上樣流速為1 BV/h，洗脫流速為2 BV/h，以3 BV水除雜，3 BV 30%乙醇洗脫，純化后產(chǎn)品中番瀉苷A、B總含量高達(dá)26.05%。結(jié)論：AB-8型樹脂適合富集純化番瀉豆莢中番瀉苷。

關(guān)鍵詞：番瀉豆莢;番瀉苷;大孔吸附樹脂;純化

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）02-0037-06 ? ? 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.02.007

Abstract：To explore the optimal technology for enrichment and purification of sennoside from senna pod with macroporous resin. Methods： The content of sennaside A and B were determined by the HPLC. By using adsorption rate and desorption rate as the indices， five kinds of macroporous resins were screened by the static adsorption test. The best macroporous resin with better adsorption and desorption properties， and the optimal purification conditions of resin were obtained based on static adsorption. Results： Experiment results showed that AB-8 resin possessed high absorption capacity. The best technical parameters were obtained as follows： saturation adsorption capacity of resins 0.21 g/g （equivalent as crude drug）， the ratio of diameter to height 1∶8， absorption flow rate 1 BV/h， desorption flow rate 2 BV/h， 3 BV water impurity， eluent with 3 BV 30% ethanol. The total content of sennoside A and B in the purified product were as high as 26.04%. Conclusion： The AB-8 macroporous adsorption resin has the best enrichment and purification efficiency for sennoside from senna pod.

Key words：senna pod; sennoside; macroporous resin; purification

番瀉為豆科決明屬的矮小灌木，高1 m左右，有狹葉番瀉（Cassia angustifolia Vahl.）和尖葉番瀉（Cassia acutifolia Lelile）之分[1]，前者主產(chǎn)于印度，后者主產(chǎn)于埃及，我國(guó)廣東、廣西、云南也有引種。番瀉葉中含有番瀉苷A、B、C、D、大黃酸、蘆薈大黃素、蘆薈大黃素雙蒽醌苷等[2-5]多種有效成分，具有瀉下、抑菌、止血、增強(qiáng)平滑肌收縮及肌肉松弛與解痙等作用[6-10]。在番瀉的所有部位中，番瀉葉是研究開發(fā)與應(yīng)用最主要的部位，番瀉豆莢多被忽略，造成資源的浪費(fèi)，并且我國(guó)番瀉葉來(lái)源主要依靠進(jìn)口，所以開發(fā)新的藥用部位以及擴(kuò)大資源利用是目前亟待解決的任務(wù)。李靜等[11]研究表明，番瀉苷A、B在番瀉豆莢中也有，且含量均比番瀉葉高。番瀉提取物是生產(chǎn)減肥藥品的重要原料藥，其主要成分為番瀉苷A、B，所以提高番瀉提取物中番瀉苷A、B含量對(duì)減肥藥生產(chǎn)市場(chǎng)具有重要意義。然而，番瀉苷A、B在番瀉豆莢中總含量?jī)H為2%左右，所以對(duì)番瀉豆莢番瀉苷A、B富集純化十分必要。大孔樹脂是一類吸附性和篩分性相結(jié)合的分離材料，選擇性及穩(wěn)定性高，操作簡(jiǎn)便、富集效果好，成本低，適宜用于工業(yè)化生產(chǎn)[12]?，F(xiàn)有研究只對(duì)番瀉葉番瀉苷進(jìn)行了富集純化[13-14]，但尚未見番瀉豆莢中番瀉苷A、B富集純化的相關(guān)報(bào)道。因此，本文首次采用大孔樹脂對(duì)番瀉豆莢番瀉苷A、B進(jìn)行富集純化研究，期望為工業(yè)生產(chǎn)高含量番瀉提取物提供理論參考，同時(shí)對(duì)拓展番瀉藥材新的藥用部位及擴(kuò)大藥源提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

干燥番瀉豆莢：2017年10月購(gòu)于廣西玉林;對(duì)照品：番瀉苷A（批號(hào)：SEA08030204，純度≥98%）、番瀉苷B（批號(hào)：SEB06040102，純度≥98%），日本藥局方標(biāo)準(zhǔn)品;AB-8、DM130、ZX-17、ADS-F8、HPD417型大孔吸附樹脂：購(gòu)于鄭州勤實(shí)科技有限公司;色譜級(jí)甲醇和乙腈：德國(guó)MERCK;碳酸氫鈉：重慶北培精細(xì)化工廠;磷酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公;水為娃哈哈水（貴陽(yáng)娃哈哈昌盛飲料有限公司）和蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

U.S（1100 series）分析型HPLC：Agilent Technology公司;BSA124S和BT25S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器;電熱恒溫水浴鍋：HH.SY21-Ni6，北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;YA·ZD·5型電熱蒸餾水器：其他為一般常規(guī)儀器。

1.3 番瀉苷A、B含量測(cè)定方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Supersil-T C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸水（20：80）;檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm;柱溫：25℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的番瀉苷A、B對(duì)照品各3.06 mg，3.60 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加入含0.1%碳酸氫鈉的30%甲醇溶液進(jìn)行超聲溶解，定容至刻度，搖勻，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 供試品溶液的制備 取番瀉豆粉末0.5 g，精密稱定置于錐形瓶中，加入0.5%碳酸氫鈉50 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz，40℃）30 min，迅速冷至室溫，補(bǔ)足原重，搖勻，0.45 μm微濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 分別置于5 個(gè)2 mL容量瓶中，用含0.1%碳酸氫鈉的30%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得番瀉苷A的回歸方程為y=7610.8 x + 24308（R.2= 0.9997），線性范圍為12.24～61.20 μg/mL，番瀉苷B的回歸方程為y= 6486.3x + 28145（R.2= 0.9997），線性范圍為14.40～72.00 μg/mL，結(jié)果表明二者線性關(guān)系良好。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取1.3.3項(xiàng)混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次峰面積。結(jié)果番瀉苷A、B峰面積值的RSD分別為0.23%，0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取番瀉豆莢6份，按1.3.3供試品溶液的制備方法制備樣品，分別精密吸取各樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算各樣品中番瀉苷A、B的含量。結(jié)果番瀉苷A、B含量的RSD分別為0.42%，0.71%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取番瀉豆莢1份，按1.3.3供試品溶液的制備方法制備樣品，分別于室溫（25℃）放置0，4，8，12，24，48 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，高效液相色譜分析，記錄峰面積，分別計(jì)算2種樣品中番瀉苷A、B含量。結(jié)果番瀉豆莢中番瀉苷A、B含量的RSD分別為0.86%，1.18%（n=6），表明該樣品制備方法制備的番瀉葉及番瀉豆莢供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取番瀉豆莢6份，每份準(zhǔn)確加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，按1.3.3供試品溶液的制備方法制備樣品，分別進(jìn)樣10 μL，高效液相色譜分析，記錄峰面積，計(jì)算各樣品中番瀉苷A、B的加樣回收率。結(jié)果番瀉苷A、B的平均回收率分別為98.49%，96.37%（n=6），加樣回收率RSD分別為0.81%，0.26%（n=6），表明該檢測(cè)方法回收率良好，符合要求。

1.3.9 上樣液的制備

稱取干燥番瀉豆莢適量，按料液比為1∶15，加入0.5%NaHCO3溶液，在70℃水浴中加熱提取2 h，過濾，二次提取，合并濾液，避光8℃保存，備用。

1.3.10 采用外標(biāo)法計(jì)算番瀉苷A、B含量

番瀉苷A、B含量（mg/mL）=（C標(biāo)（mg/mL）×A樣×0.98）/A標(biāo)，其中C標(biāo)為對(duì)照品濃度;A樣為樣品峰面積;A標(biāo)為對(duì)照品峰面積。

1.4 靜態(tài)吸附篩選大孔吸附樹脂型號(hào)

1.4.1 大孔樹脂預(yù)處理[15]

準(zhǔn)確稱取5種樹脂濕重各20 g，先用95%乙醇充分浸泡樹脂24 h，再用大量蒸餾水洗滌，洗滌至無(wú)醇味。然后用4倍樹脂體積量的5%HCl溶液攪拌浸泡3 h除去堿性物質(zhì)，用蒸餾水洗至中性。再用4倍樹脂體積量的5%NaOH溶液攪拌浸泡3 h，除去酸性物質(zhì)，最后用蒸餾水洗至中性即可使用。

1.4.2 樹脂靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5種樹脂濕重各10.0 g 置于具塞錐形瓶中，分別加入上樣液140 mL，置25℃恒溫?fù)u床，120 r/min的速率振蕩吸附15 h，使番瀉苷充分吸附，過濾測(cè)定并計(jì)算濾液中番瀉液苷A、B總含量，將濾過大孔樹脂用大量水洗后，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，加入70%乙醇溶液150 mL，置于25 ℃恒溫震蕩床解吸15 h，使番瀉苷充分被解吸，測(cè)定并計(jì)算流出液中番瀉苷A、B總含量。

1.5 AB-8樹脂富集純化番瀉苷工藝參數(shù)考察

1.5.1 泄露曲線的考察

取900 mL上樣液，上50 mL （40.0 g） AB-8樹脂柱，每50 mL收集一份流出液，共收集16份，測(cè)定并計(jì)算解吸液中番瀉苷A、B總質(zhì)量濃度。

1.5.2 上樣流速對(duì)番瀉苷吸附效果的影響

取處理好的50 mL（40.0 g） AB-8樹脂各3份，分別濕法裝入相同規(guī)格的層析柱中，再取3份250 mL等質(zhì)量濃度番瀉苷A、B提取液上柱，并控制上樣流速分別為1、2、3 BV/h進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，分別收集流出液，測(cè)定并計(jì)算流出液中番瀉苷A、B總含量。

1.5.3 洗脫流速對(duì)番瀉苷解吸效果的影響

取處理好的50 mL （40.0 g） AB-8樹脂各3份，分別濕法裝入相同規(guī)格的層析柱中，再取3份250 mL等質(zhì)量濃度番瀉苷A、B提取液均以1 BV/h上柱，分別控制洗脫流速為1、2、3 BV/h進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸，先水洗至流出液無(wú)顏色，記下用水量為3 BV，再用30%乙醇洗脫，分別收集150 mL 30%乙醇洗脫液，測(cè)定并計(jì)算洗脫液中番瀉苷A、B總含量。

1.5.4 洗脫劑濃度的確定

將處理好的100 mL AB-8樹脂濕法裝柱，上樣500 mL，上樣流速為1 BV/h，水洗至流出液無(wú)顏色，再依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇各3 BV進(jìn)行洗脫，洗脫流速2 BV/h，分別收集各乙醇洗脫液，測(cè)定并計(jì)算洗脫液中番瀉苷A、B總含量。

1.5.5 洗脫劑用量的考察

將450 mL上樣液上100 mL AB-8柱，3 BV水除雜后，用5 BV 30%乙醇洗脫，100 mL收集一份洗脫液，測(cè)定并計(jì)算洗脫液中番瀉苷A、B總含量。

1.5.6 樹脂徑高比對(duì)番瀉苷吸附及解吸效果的影響

取3根等規(guī)格的樹脂柱，濕法裝入處理好的AB-8，使徑高比分別為1∶4、1∶6和1∶8，上相應(yīng)比例量的等質(zhì)量濃度上樣液，用3 BV水除雜、再用5 BV 30%乙醇洗脫，收集每1 BV 30%乙醇洗脫液，測(cè)定并計(jì)算提取物中番瀉苷A、B總質(zhì)量濃度。

1.5.7 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

平行稱取番瀉豆莢15.0 g三份，按1.3.8方法制得番瀉豆莢上樣液，按確定的最優(yōu)純化工藝，即以AB-8樹脂床徑高比為1∶8，上樣流速為1 BV/h，洗脫流速為2 BV/h上，3 BV水去雜，3 BV 30%乙醇洗脫，收集30%乙醇洗脫液，70℃真空濃縮至干，稱重，測(cè)定并計(jì)算解吸液中番瀉苷A、B總含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹脂靜態(tài)吸附率及解吸率的比較

由表1可知，在靜態(tài)吸附飽和狀態(tài)下，5種樹脂中對(duì)番瀉豆莢番瀉苷吸附量最大的是AB-8型大孔樹脂，達(dá)到9.16 mg/g，是DM130的1.22倍，更明顯高于其他3種樹脂。同時(shí)在靜態(tài)洗脫中，對(duì)番瀉苷解吸率最大的也是AB-8，其解吸能力最強(qiáng)。綜合吸附及解吸性能分析，選用AB-8型吸附樹脂富集純化番瀉豆莢番瀉苷。

2.2 泄漏曲線的考察

通過分析圖1可知，流份6與流份5相比，番瀉苷質(zhì)量濃度明顯升高，即樹脂柱出現(xiàn)泄漏現(xiàn)象，此時(shí)上樣總體積為250 mL，相當(dāng)于含有8.3 g生藥。因此，確定AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)番瀉豆莢番瀉苷的飽和吸附量為0.21 g/g。

2.3 上樣流速對(duì)番瀉苷吸附效果的影響

通過分析圖2可知，隨著上樣流速的增大，流出液中番瀉苷A、B總含量也隨之增高，說明高流速上樣時(shí)目標(biāo)成分損失大，低流速可使目標(biāo)成分充分吸附于樹脂，綜合考慮，選擇上樣流速為1 BV/h。

2.4 洗脫流速對(duì)番瀉苷解吸效果的影響

通過分析圖3可知，洗脫液中番瀉苷A、B總含量最高的是洗脫流速為1 BV/h時(shí)，其次是洗2 BV/h時(shí)，但是二者相差不大，說明2種洗脫流速下番瀉苷解吸充分，而洗脫流速為3 BV/h時(shí)，洗脫液中番瀉苷A、B總含量極低，說明解吸不完全。綜合解吸效果及時(shí)間考慮，確定洗脫流速為2 BV/h。

2.5 洗脫劑濃度的確定

通過分析圖4可知，當(dāng)乙醇濃度小于30%時(shí)，洗脫液中番瀉苷A、B總含量隨洗脫劑濃度的增高而增加;當(dāng)乙醇濃度大于30%時(shí)，洗脫液中番瀉苷A、B總含量呈下降趨勢(shì)，40%以及更高濃度乙醇洗脫液中番瀉苷A、B總含量甚微，即用30%乙醇就能最大限度將番瀉苷解吸完全，故確定最佳洗脫溶劑為30%乙醇。

2.6 洗脫劑用量的考察

通過分析圖5可知，第2 BV 30%乙醇洗脫液中番瀉苷A、B總含量已達(dá)到最大值，第3 BV 30%乙醇洗脫液中番瀉苷A、B總含量甚微，說明已基本解吸完全，因此，確定3 BV為30%乙醇洗脫劑最佳用量。

2.7 樹脂徑高比對(duì)番瀉苷吸附及解吸效果的影響

通過分析圖6可知，當(dāng)徑高比為1∶8時(shí)，番瀉苷集中被第1、2 BV洗脫劑解吸出來(lái)，此時(shí)番瀉苷質(zhì)量濃度是徑高比為1∶4、1∶6相應(yīng)量的2倍，這可能是樹脂床過短導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)泄漏引起，三者比較，徑高比為1∶8時(shí)分離效果最好，利于得到高含量產(chǎn)品，因此確定1∶8為最佳徑高比。

2.8 工藝驗(yàn)證

由表2可知，富集純化番瀉豆莢中番瀉苷平均含量高達(dá)26.05%，平均回收率為90.24%。由圖7可知，經(jīng)該工藝的富集純化后，可得到較高含量的番瀉苷提取物，其HPLC圖如圖7-c，原料HPLC圖為7-b，二者圖譜對(duì)比表明，該工藝能有效去除提取液中部分雜質(zhì)，使目標(biāo)成分含量提高，因此，該優(yōu)化工藝對(duì)番瀉豆莢番瀉苷富集純化有顯著效果，且工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)番瀉來(lái)源少，用量大，充分利用現(xiàn)有資源以及提高番瀉提取物的含量一直是亟待解決的問題。而大孔樹脂富集純化番瀉豆莢中番瀉苷的研究尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)通過靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)研究了5種型號(hào)不同的大孔樹脂富集純化番瀉豆莢中的番瀉苷，結(jié)果表明，AB-8型樹脂對(duì)番瀉豆莢番瀉苷的吸附和解吸附能力較好，具有良好的富集純化作用。富集純化工藝篩選得到的最佳參數(shù)如下：樹脂對(duì)番瀉豆莢生藥的飽和吸附量為0.21 g/g，上樣流速為1 BV/h，洗脫流速為2 BV/h，樹脂徑高比為1∶8，3BV水去雜，30%乙醇為洗脫溶劑，洗脫溶劑量為3 BV。

大孔樹脂分離法與其他純化方法在富集有效成分方面相比較，具有減少雜質(zhì)的突出優(yōu)越性，本論文番瀉豆莢番瀉苷富集純化工藝操作溫和簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)合理，為番瀉資源的全面開發(fā)與利用提供了技術(shù)支持。

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