丁華杰　葉云　高強　鐘英英

摘??? 要：為了研究白藜蘆醇抗乳腺癌的作用機制，從GEO數據庫獲取用白藜蘆醇處理過的乳腺癌的表達譜數據集（GSE25412），通過BRB軟件包獲取差異表達基因;對差異基因進行功能聚類和蛋白-蛋白相互作用分析，GSEA對乳腺癌進行基因集富集分析;最后通過CMAP對藥物作用機制或藥理作用進行預測.結果：通過對比白藜蘆醇和乙醇作用于MCF7細胞基因表達譜 ，獲得763個顯著差異基因，其中上調基因262個，下調基因501個;GSEA主要富集到細胞代謝等18條與乳腺癌相關的信號通路;蛋白相互作用網絡的分析結果顯示：IFI44可能成為藥物作用新靶點.CMAP分析結果顯示：白藜蘆醇的抗乳腺癌作用機制復雜，分析結果顯示與激素作用、HDAC抑制劑、hsp90抑制劑、PI3K抑制劑等有關.研究結果表明：基于基因表達譜的乳腺癌組織與正常組織的篩選比對，為抗腫瘤藥物發(fā)現提供新思路，為后期的相關臨床研究提供重要信息.

關鍵詞：白藜蘆醇;乳腺癌;基因表達譜;生物信息學

中圖分類號：R737.9????????????????? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2019.02.012

0??? 引言

白藜蘆醇（Resveratrol）來源較廣泛，可以直接從葡萄、草莓、花生等植物中提取[1].近年來，白藜蘆醇抗腫瘤活性的研究日趨白熱化，成為研究者關注的重點.現有的研究表明，白藜蘆醇具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖作用，尤其對于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等常見腫瘤[2-3].然而，腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學過程是十分復雜且多樣性的，目前對于白藜蘆醇的抗癌機理還不夠明確.

基因芯片和生物信息學分析可以從全基因組探討白藜蘆醇抗乳腺癌的作用機理.近10年來，基因表達譜芯片在腫瘤研究中得到廣泛應用，是探索體內腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中基因表達譜變化的強有力的工具.尤其是在探索腫瘤發(fā)生發(fā)展機制、作用機理、腫瘤基因分型、指導治療、評估預后等領域有重要價值[4-7].本研究利用基因芯片高通量的優(yōu)點，對白藜蘆醇處理和對照的乳腺癌細胞進行基因表達譜比較分析，深入分析潛在的作用機制，為研究白藜蘆醇治療乳腺癌作用提供可參考的理論依據[8].

1??? 材料與方法

1.1?GEO數據集的獲取

本研究采用的白藜蘆醇抗乳腺癌表達譜數據（GSE25412）是從Pubmed的GEO數據庫（http：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中獲取.該數據集采用Affymetrix公司的Human Gene 1.0 STArray芯片平臺，包括9個基因表達譜數據，用乙醇處理過的3個對照樣本以及白藜蘆醇處理過的6個實驗樣本.用來研究的生物樣本為：用兩種濃度（150和250 μmol/L）的白藜蘆醇（實驗組）或（150和250 μmol/L）乙醇處理（對照組）48 h的MCF7細胞系.

1.2?差異表達基因的篩選

對實驗數據進行歸一化處理，對處理過的數據采用BRB-ArrayTools軟件包進行差異基因的分析.BRB-ArrayTools可以被用來分析多種通道的基因芯片數據，具體使用方法可從網站http：//linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools/獲得[9]，其中篩選條件為：FDR=10%、可信度95%、permutation為1 000次、2-fold change.

1.3?GSEA信號通路富集分析

從GSEA網站MsigDB數據庫中，共獲得310個與生物信號傳導相關的基因集作為參考基因集.每次分析重復1 000次，標準化的P<0.05的基因集定義為陽性基因集[10].

1.4?生物功能聚類分析

GO注釋收集了來源于Gene?ontology和NCBI（www.ncbi.nih.gov/gene/data/GO（Gene ontology））數據庫的信息.對獲取的差異表達基因進行GO功能富集分析，以此來表述白藜蘆醇抗乳腺癌的作用機制，為后續(xù)分析提供理論基礎.

1.5?? 生物信號通路分析

采用DAVID（http：//david.Abcc.Ncifcrf.gov/）數據庫對獲取的上、下調差異基因進行對比.了解這些差異基因的生物學功能;利用KEGG數據庫找到與這些基因對應的通路，進一步分析白藜蘆醇抗乳腺癌作用機制.

1.6?? 蛋白相互作用網絡分析

將上述分析結果得出的上、下調差異基因在STRING（http：//www.string- db.org/）數據庫中進行比對，得到蛋白-蛋白相互作用網絡.進一步獲得核心基因.

1.7?? CMAP篩選乳腺癌治療藥物

Connectivity map（CMAP）數據庫可以探索疾病及其相關基因的聯系，挑選出靶向作用于基因的藥物.為了進一步探討白藜蘆醇抗乳腺癌作用機制，將上述獲得的差異上調、下調基因分別導入CMAP數據庫中，按CMAP使用說明操作，進行藥物[11-12]篩選分析.

2??? 結果與分析

2.1?? 基因芯片數據預處理

對芯片數據壓縮后，將數據導入BRBArrayTools軟件包，并自動生成試驗文件.對數據進行標準化處理，標準化處理前后的結果如圖1所示.

2.2?? 差異表達基因篩選的結果

通過對比白藜蘆醇和乙醇分別作用于MCF7細胞系的表達譜變化，共篩選出763個顯著差異基因，其中上調基因262個，下調基因501個.

2.3?? GSEA信號通路富集分析結果

采用GSEA對所獲取的差異表達數據進行富集分析，發(fā)掘與乳腺癌發(fā)生發(fā)展有關系的作用機制，獲取有密切聯系的基因及信號通路，詳細結果見表1、圖2.結果顯示：主要包括細胞代謝、細胞周期調控、細胞運動、物質代謝等18條生物信號通路與乳腺癌的發(fā)生機制有著密切關系.

2.4?? 功能聚類分析

本研究對作用于白藜蘆醇MCF7細胞的差異顯著基因進行信號通路分析：在下調基因中，并未獲得具有統(tǒng)計學意義的信號通路;在上調基因中，通過GO分析，主要涉及負調控凋亡過程、調節(jié)細胞增殖、細胞增殖、對藥物的反應、凋亡過程等（見圖3）.

2.5?? 信號通路分析

通過KEGG分析，在上調基因中，主要涉及p53信號通路、TNF信號通路、破骨細胞分化、PK信號傳導途徑（如圖4所示）.

2.6??? 候選基因蛋白產物相互作用分析

在蛋白互作分析網絡中，選出了IFI44、KNTC1、HIST1H2AB、CDCA2、PSMC3IP、KLHL5、ATAD5、PGR這8個節(jié)點度最高的基因，即為核心基因.

2.7?? CMAP分析結果

本研究采用CMAP數據庫從基因層面上發(fā)掘白藜蘆醇抗乳腺癌作用機制，與數據庫中現存藥物進行比對，篩選出功能最為相似的藥物.將乳腺癌差異表達基因與CMAP數據庫中藥物表達譜進行對比，在藥物篩選中，首先過濾掉檢測次數<5、P<0.05的藥物，結合Enrichment及P值兩項參數，獲得了白藜蘆醇與伏立諾他、15δ前列腺素J2、LY-294002、坦螺旋霉素、西羅莫司等13種抗癌藥物表達譜的變化相似，表明了白藜蘆醇抗癌作用主要與激素、抗炎、抗菌等作用有關（見表2）.

3??? 討論

本研究通過發(fā)掘基因圖譜數據庫，并對比白藜蘆醇和乙醇分別作用于MCF7細胞系和正常細胞系的表達譜變化，總共獲得差異基因數量763個.其中上調基因262個，下調基因501個.基因生物過程分析結果顯示，白藜蘆醇主要通過正向調控凋亡過程、細胞增殖、調節(jié)細胞增殖、對藥物的反應等過程的基因進而發(fā)揮抗乳腺癌作用.

腫瘤發(fā)生發(fā)展機制過程中的一個重要特征是信號傳導通路的紊亂或異常.為了揭示乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中主要存在的差異表達異常通路，采用GSEA對所獲取的表達譜數據進行通路富集分析.結果發(fā)現與乳腺癌發(fā)生發(fā)展有著密切關系的信號通路主要有：細胞代謝、細胞周期調控、細胞運動、物質代謝等????? （表1），與現有的研究報道相似[13-14].在隨后的CMAP分析中，篩選到的藥物與GSEA的分析結果相吻合：如伏立諾他、HDAC抑制劑如曲古抑菌素A可以誘導細胞分化和（或）凋亡，hsp90抑制劑如坦螺旋霉素、格爾德霉素可干擾細胞周期，秋水仙堿可抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期.也有實驗表明[15]，秋水仙堿可用于靶向治療乳腺癌，白藜蘆醇可以通過參與miRNA過客鏈的降解、代謝，進而降低乳腺癌干細胞的數量，并且現有實驗表明[16]，白藜蘆醇有很大潛力作為一種靶點藥物來治療乳腺癌.基于上述分析，認為本研究所采用的基于基因表達譜篩選藥物的模式是可行的，可以有效地篩選到一些治療乳腺癌的候選藥物，為腫瘤治療提供一定的理論依據.

本研究發(fā)現，白藜蘆醇主要通過PIK3、p53、破骨細胞分化、TNF（腫瘤壞死因子）、溶酶體、HTLV-I感染等信號通路中的相關基因發(fā)揮抗癌作用.通過對乳腺癌患者組織基因芯片與正常組織基因芯片進行分析，結果顯示差異表達的基因主要富集于細胞周期和DNA復制等信號通路中.在蛋白互作分析網絡中（如圖5所示），篩選出IFI44、KNTC1、HIST1H2AB、CDCA2、PSMC3IP、KLHL5、ATAD5、PGR這8個關鍵基因，其中干擾素誘導基因IFI44具有較高的表達，也提示癌細胞中的DNA復制明顯異于正常細胞.Nikolai等[17]的研究表明，IFI44等19種基因是干擾素誘導路徑的成分，其中IFI44等極有可能參與了對射線的抵抗，而化療又是當今比較普遍的癌癥治療手段之一.由此可以推斷，進一步探討乳腺癌關鍵基因IFI44的調控機制顯得尤為重要，為后續(xù)的乳腺癌和其他癌癥治療提供幫助.

為了進一步探討白藜蘆醇抗乳腺癌作用機制，采用了CMAP對藥物進行預測分析，篩選到伏立諾他、曲古抑菌素A、15δ前列腺素J2、LY-294002、坦螺旋霉素、西羅莫司、格爾德霉素等13種候選藥物與白藜蘆醇處理乳腺癌的表達譜相似，這些候選藥物主要歸類于HDAC抑制劑、植物抗毒素、PPAR受體激動劑、抗真菌和免疫抑制劑、PI3K抑制劑、hsp90抑制劑和抗腫瘤藥等.CMAP表達譜結果顯示，白藜蘆醇抗乳腺癌表達的富集分數較高，在抗乳腺癌方面具有較好的表達，更進一步說明白藜蘆醇具有較好的抗乳腺癌作用.結果中發(fā)現，西羅莫司作為一種新型的免疫抑制劑也出現在表達譜結果中.現今關于西羅莫司在抗癌，尤其是抗乳腺癌方面研究較少，主要用于臨床上的器官移植的抗排斥反應和自身免疫性疾病的治療.西羅莫司有望在治療乳腺癌方面起到一定的作用，成為治療乳腺癌的候選藥物，為后期的研究提供一定的參考.

傳統(tǒng)的治療方法如化療、放療等對機體正常細胞都有或多或少的損傷，因而不能在臨床上大劑量的應用.體內外研究證明[18-20]，白藜蘆醇的抗乳腺癌機制是多通路、多靶點的，相比傳統(tǒng)化學治療藥，具有來源廣泛、抗癌譜廣、毒副反應小等優(yōu)點[21].因此，基于白藜蘆醇的功效，開發(fā)出一種新型的抗乳腺癌的藥物，且作為一種天然中草藥提取物，具有一定的開發(fā)前景.目前雖然對白藜蘆醇抗腫瘤機制的研究很多，但作為抗腫瘤藥應用于臨床仍需進一步的研究證實.

參考文獻

[1]?鐘英英，鐘春鵬，凌秋萍，等. 葡萄愈傷組織中白藜蘆醇提取工藝的研究[J]. 廣西科技大學學報，2014，25（4）：97-99.

[2]?AGGARWAL B B， BHARDWAJ A， AGGARWAL R S， et al. Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer： preclinical and clinical studies[J]. Anti Cancer Res，2004，24（5A）：2783.

[3]?LU M，CAI Y J，FANG J G，et al. Efficiency and structure-activity relationship of the antioxidant action of resveratrol and its analogs[J]. Pharmazie Die，2002，57（7）：474-478.

[4]?GLINSKY G V，GLINSKII A B，STEPHENSON A J，et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of prostate cancer[J]. Journal of Clinical Investigation，2004，113（6）：913-923.

[5]?KORRAT A，GREINER T，MAURER M，et al. Gene signature-based prediction of tumor response to cyclophosphamide[J]. Cancer Genomics & Proteomics，2007，4（4）：187-195.

[6]?TALBOT S G，ESTILO C，MAGHAMI E，et al. Gene expression profiling allows distinction between primary and metastatic squamous cell carcinomas in the lung[J]. Cancer Research，2005， 65（8）：3063-3071.

[7]?LARSEN J E，PAVEY S J，PASSMORE L H，et al. Expression profiling defines a recurrence signature in lung squamous cell carcinoma[J]. Carcinogenesis，2007，28（3）：760.

[8]?周漩，李占潮. 基于生物信息學的乳腺癌miRNA生物標志物的篩選[J]. 廣東藥科大學學報， 2017，33（3）：412-414.

[9]?XU X，ZHAO Y，SIMON R. Gene set expression comparison kit for BRB-arraytools[J]. Bioinformatics，2008，24（1）：137-139.

[10]?葉云，鐘英英，蔣東通. 阿科特素體外處理乳腺癌細胞的基因表達通路分析[J]. 廣西工學院學報，2013，24（4）：71-75.

[11]?GULLANS S R. Connecting the dots using gene-expression profiles[J]. New England Journal of Medicine，2006，355（19）：2042.

[12]?LAMB J，CRAWFORD E D，PECK D，et al. The connectivity map：using gene-expression signatures to connect small molecules，genes，and disease[J]. Science，2006，313（5795）：1929-1935.

[13]?HEAD J，JOHNSTON S R. New targets for therapy in breast cancer：farnesyltransferase inhibitors[J]. Breast Cancer Research Bcr，2004，6（6）：262-268.

[14]?ROSEN L S，ASHURST H L，CHAP L. Targeting signal transduction pathways in metastatic breast cancer：a comprehensive review[J]. Oncologist，2010，15（3）：216-2135.

[15]?朱海燕. 秋水仙堿修飾的納米硒靶向MCF-7細胞誘導其凋亡的研究[D].廣州：暨南大學，2016.

[16]?LUCCHINI F. Resveratrol and breast cancer risk[J]. European Journal of Cancer Prevention the Official Journal of the European Cancer Prevention Organisation，2005，14（2）：139.

[17]?KHODAREV N N，BECKETT M，LABAY E，et al. STAT1 is overexpressed in tumors selected for radioresistance and confers protection from radiation in transduced sensitive cells[J]. Procnatlacadsciusa，2004，101（6）：1714-1719.

[18]?FILOMENI G，GRAZIANI I，ROTILIO G，et al. Trans-resveratrol induces apoptosis in human breast cancer cells MCF-7 by the activation of MAP kinases pathways[J]. Genes and Nutrition，2007， 2（3）：295-305.

[19]?EULALIA P G，M JES S L B，FERN NDEZ-SALGUERO P M. Resveratrol modulates the phosphoinositide 3-kinase pathway through an estrogen receptor alpha-dependent mechanism：relevance in cell proliferation[J]. International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2010，109（2）：167.

[20]?REAGANSHAW S，MUKHTAR H，AHMAD N. Resveratrol imparts photoprotection of normal cells and enhances the efficacy of radiation therapy in cancer cells[J]. Photochemistry and Photobiology，2010，84（2）：415-421.

[21]?仇鳳啟，丁曉超，馬萍. 白藜蘆醇抗乳腺癌的多靶點機制[J]. 國際腫瘤學雜志，2013，40（2）：114-117.

Analysis of gene expression pathway in breast cancer cells treated with resveratrol

DING Huajie， YE Yun， GAO Qiang， ZHONG Yingying*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology，

Liuzhou 545006， China）

Abstract： Based on gene expression profile data， breast cancer related genes and signaling pathways， as well as resveratrol anti-breast cancer mechanism， the expression profile data set （GSE25412） of breast cancer treated with resveratrol was obtained from the GEO database. Differentially expressed genes were obtained by BRB software package; functional clustering and protein-protein interaction analysis of differential genes and GSEA Gene set enrichment analysis of breast cancer were made;?????? finally， the mechanism of action or pharmacological action of the drug was predicted by CMAP. By comparing the gene expression profiles of resveratrol and ethanol in MCF7 cells， 763 significant??????? differential genes， 262 up-regulated genes and 501 down-regulated genes were obtained. GSEA was mainly enriched with 18 breast cancer-related signals. Analysis of protein interaction network shows that IFI44 may become a new target for drug action. The results of CMAP analysis showed that the??? anti-breast cancer mechanism of resveratrol was complicated， and the results showed that it was related to hormone action， HDAC inhibitor， hsp90 inhibitor and PI3K inhibitor. Therefore， screening of breast cancer tissue and normal tissue based on gene expression profile provides new ideas for anti-tumor drug discovery and gives important information for later clinical research.

Key words： resveratrol; breast cancer; gene expression profile; bioinformatics