徐寧 馮立國 王春暉 等

摘要：【目的】優(yōu)化黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，為大規(guī)模培養(yǎng)黑皮雞樅液體栽培菌種及提高黑皮雞樅菌產(chǎn)量和品質(zhì)提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎靡后w發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)，以黑皮雞樅液體菌種的菌球直徑、均勻度、菌絲干重、漆酶、纖維素酶和多酚氧化酶活性為指標，通過單因素試驗和均勻試驗，優(yōu)化碳（C）源、氮（N）源、碳氮添加量比（C/N）、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間，篩選出黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝，并開展液體菌種栽培試驗?！窘Y(jié)果】黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為20.0 g葡萄糖+4.0 g高粱粉+3.0 g K2HPO4+1.0 g MgSO4+2片維生素B1+1000.0 mL蒸餾水，pH 6.5;發(fā)酵工藝：裝液量12 L，接種量12%，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速90 r/min，培養(yǎng)時間100 h，罐壓0.3 MPa，通氣量0.9 m3/h。栽培試驗結(jié)果表明，在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝條件下獲得的液體菌種其栽培黑皮雞樅菌絲生長速度快，滿袋時間為29 d，平均每袋產(chǎn)量約360.0 g，生物學轉(zhuǎn)化率達78.0%。【結(jié)論】將液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)與工廠化栽培技術(shù)有機結(jié)合，可實現(xiàn)黑皮雞樅菌的規(guī)?；?、標準化、現(xiàn)代化和工廠化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 黑皮雞樅;液體菌種;發(fā)酵罐培養(yǎng)

中圖分類號： S646.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0344-06

Abstract：【Objective】The culture conditions of fermenting tanks for Oudemansiella? raphanipes liquid strain were optimized，which provided reference for large-scale cultivation of liquid culture strains and the improvement of the yield and quality of O. raphanipes. 【Method】Using liquid fermenter culture technology，the ball diameter，uniformity，dry weight of the mycelium，laccase activity， cellulase activity and polyphenol oxidase activity of the liquid strain of O. raphanipes were used as indicators. Through single factor and uniform experiments，optimized carbon（C） source，nitrogen（N） source，carbon and nitrogen add ratio（C/N），inoculum amount，volume of liquid，culture temperature and incubation time， the optimum medium and fermentation process of O. raphanipes liquid strains were screened，and the cultivation experiment of liquid strain was carried out. 【Result】The best medium for fermentation of O. raphanipes liquid strains by fermenter：glucose 20.0 g+sorghum powder 4.0 g+K2HPO4 3.0 g+MgSO4 1.0 g+vitamin B1 2 tablets+distilled water 1000.0 mL，pH 6.5. Fermentation process：liquid content 12 L，inoculation amount 12%，culture temperature 25 ℃，stirring speed 90 r/min，culture time 100 h，tank pressure 0.3 MPa，ventilation volume 0.9 m3/h. The results of the cultivation experiment showed that the mycelium of the O. raphanipes cultivated in the liquid culture under the optimal medium and the optimum process conditions had a fast growth rate，the mycelium full bag time was 29 d，and the average yield each bag was about 360.0 g. The biological conversion rate reached 78.0%. 【Conclusion】It is possible to realize the large-scale，standardized and modern industrial production of O. raphanipes by combining the liquid strain fermenter production technology with the industrial cultivation technology.

Key words： Oudemansiella raphanipes; liquid strain; fermenter culture

0 引言

【研究意義】黑皮雞樅（Oudemansiella raphanipes）屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、傘菌科，是珍稀且藥食用價值極高的食用菌，與松茸、羊肚、黑虎掌同列為我國四大名菌，被譽為菌中之冠（Kirk et al.，2001;Saha，2008;付子艷和李榮春，2009）。目前，液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應用于食用菌生產(chǎn)，但仍存在菌絲質(zhì)量差、菌球生產(chǎn)時間長及菌球大小不均勻等缺點。食用菌的菌種質(zhì)量直接關(guān)系到產(chǎn)量和質(zhì)量，而在實際生產(chǎn)中對黑皮雞樅液體菌種培養(yǎng)條件尚不完全清楚。因此，優(yōu)化黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，對實現(xiàn)黑皮雞樅大規(guī)模栽培及提高黑皮雞樅菌的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)關(guān)于雞樅菌液體菌種培養(yǎng)的研究主要集中在搖瓶培養(yǎng)條件篩選等方面，而與發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)相關(guān)的研究較少。胡忠策和鄭曉冬（2002）對雞樅菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，結(jié)果表明，當培養(yǎng)基組成為4.29%大米水解糖、0.31% KH2PO4、0.53%酵母粉和pH 4.5時，在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5 d，雞樅菌的生物量達19.8 g/L。胡尚勤等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，雞樅菌菌絲體在碳（C）源為葡萄糖、氮（N）源為氨基酸時，最適C∶N為12～14∶1。羅曉妙（2010）研究表明，利用天然營養(yǎng)培養(yǎng)基篩選出較適宜雞樅菌菌絲體生長的搖瓶培養(yǎng)基配方為玉米粉20.0 g/L+麩皮10.0 g/L+少量維生素B1（VB1）和維生素C（Vc），在此培養(yǎng)基基礎(chǔ)上的培養(yǎng)條件為pH 4.5、溫度27 ℃、轉(zhuǎn)速90 r/min。曾先富等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，在25～33 ℃、pH 6.0～7.0、以葡萄糖為C源、酵母膏為N源的培養(yǎng)基上，雞樅菌菌絲生長速度快，菌絲粗壯、濃白、致密。熊亞和李敏杰（2013）采用響應面試驗研究C源、N源和生長因子對雞樅菌菌絲體產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，在添加20.233 g/L葡萄糖、2.146 g/L蛋白胨和0.149 g/L維生素B6的培養(yǎng)基中菌絲體干重最重。薛林浩等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，pH、麩皮、玉米粉、大豆粉、K2HPO4和MgSO4對液體發(fā)酵的黑皮雞樅生物量和形態(tài)均有較明顯影響。徐兵等（2017）研究認為，黑皮雞樅菌種搖瓶液體發(fā)酵最適條件為培養(yǎng)溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速175 r/min、pH 7.6、發(fā)酵周期25 d。李艷麗（2018）研究發(fā)現(xiàn)，秦嶺地區(qū)野生雞樅菌菌絲搖瓶液體培養(yǎng)最佳營養(yǎng)條件為2.15%葡萄糖、0.22%酵母膏、20.00%馬鈴薯、0.27% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O和0.015%維生素B1;菌絲搖瓶液體培養(yǎng)環(huán)境條件為pH 6.0，裝液量300.0 mL（500.0 mL三角瓶）、溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于利用發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)黑皮雞樅液體菌種的研究尚無文獻報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】優(yōu)化黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，以獲得可用于大規(guī)模栽培黑皮雞樅的液體菌種，為提高黑皮雞樅菌的產(chǎn)量和品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

黑皮雞樅菌株015由湖南農(nóng)業(yè)大學提供，黑皮雞樅菌株018由湖南省食用菌研究所提供，黑皮雞樅菌株016由湖南省微生物研究院提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 斜面菌種制備 將菌種接于斜面培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，作為下一步搖瓶培養(yǎng)的菌種。

1. 2. 2 搖瓶菌種制備 于500 mL三角瓶中裝入250.0 mL培養(yǎng)基，在121 ℃、0.12 MPa壓力下滅菌30 min。冷卻后每瓶接入3塊1.0 cm2經(jīng)活化的斜面菌種，25 ℃、90 r/min搖床培養(yǎng)5 d，得到液體菌種。

1. 2. 3 液體培養(yǎng)基C源、N源及其添加量比（C/N）優(yōu)化 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3.0 g K2HPO4+1.0 g MgSO4+2片維生素B1+1000.0 mL蒸餾水，pH 6.5。C源優(yōu)化：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加4.0 g高粱粉為N源，再分別添加20.0 g葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖為C源。采用15 L發(fā)酵罐，裝液量12 L，接種量12%，轉(zhuǎn)速90 r/min，罐壓0.3 MPa，通氣量0.9 m3/h，于25 ℃培養(yǎng)100 h后取樣觀察菌絲長勢，測定菌絲生長速度。N源優(yōu)化：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加20.0 g葡萄糖為C源，再分別添加4.0 g黃豆粉、玉米粉、大米粉、高粱粉為N源。采用15 L發(fā)酵罐，裝液量12 L，接種量12%，轉(zhuǎn)速90 r/min，罐壓0.3 MPa，通氣量0.9 m3/h，于25 ℃培養(yǎng)100 h后取樣觀察菌絲長勢，測定菌絲生長速度。

通過C源和N源的單因子試驗（表1），篩選出黑皮雞樅菌種搖瓶培養(yǎng)最適的C源和N源。采用均勻試驗設(shè)計，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行C源、N源和C/N優(yōu)化試驗。其因素及水平設(shè)計見表2。

1. 2. 4 發(fā)酵工藝優(yōu)化 在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間進行優(yōu)化，以獲得黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐發(fā)酵工藝。

采用15 L發(fā)酵罐，分別設(shè)10、11和12 L 3種裝液量，10%、12%和15% 3種接種量，20、25和30 ℃ 3種培養(yǎng)溫度和80、100和120 h 3種培養(yǎng)時間。將裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐于121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入搖瓶培養(yǎng)的種子液，加入消泡劑大豆植物油，在轉(zhuǎn)速90 r/min、罐壓0.2 MPa、通氣量0.9 m3/h條件下培養(yǎng)，獲得液體菌種。發(fā)酵結(jié)束后取樣，通過顯微鏡觀察菌液雜菌污染情況、菌絲體形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)特點及菌液顏色，測定菌絲球直徑、菌絲體干重及菌液纖維素酶、漆酶和多酚氧化酶活性。

1. 2. 5 栽培試驗 在無菌接種室將發(fā)酵罐培養(yǎng)的液體菌種注入栽培袋中，每袋注入3.0 mL后置于20 ℃無菌培菌室培養(yǎng)，菌絲長滿菌袋后進行出菇培養(yǎng)。

1. 3 測定指標及方法

1. 3. 1 菌絲體干重測定 將濾紙于60 ℃烘至恒重后過濾菌液，獲得菌絲體，菌絲體經(jīng)蒸餾水洗滌，5000 r/min離心取沉淀，重復數(shù)次后抽濾脫水，真空冷凍干燥至恒重后稱重，計算菌絲體干重。

1. 3. 2 菌絲球長度測定 隨機取菌球20個，排列成直線，測其總長度，重復3次，取平均值。

1. 3. 3 纖維素酶活性測定 參照白燕和王維新（2012）的方法，采用3，5-二硝基水楊酸法測定纖維素酶活性。纖維素酶活性以樣品與底物反應30 min后光密度的改變值表示，單位為U。

纖維素酶活性=N×OD值對應的葡萄糖量/30×1

式中，N為酶液稀釋倍數(shù)，30為糖化所用時間（min），1為反應酶液體積（mL）。

1. 3. 4 漆酶活性測定 參照朱海瀟（2008）的方法測定漆酶活性=ΔOD600/mL，單位為U。

1. 3. 5 多酚氧化酶活性測定 參照孫月娥等（2011）的方法測定多酚氧化酶活性，測定時粗酶液稀釋20倍。多酚氧化酶活性=ΔOD410/mL，單位為U。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黑皮雞樅液體菌種培養(yǎng)基C源、N源和C/N的優(yōu)化結(jié)果

2. 1. 1 不同C源對黑皮雞樅菌絲生長的影響 由表3可知，不同C源培養(yǎng)的黑皮雞樅菌絲長勢存在差異，生長速度間差異顯著（P<0.05，下同），其中以葡萄糖為C源的黑皮雞樅菌絲生長速度為0.41 cm/d，顯著快于以蔗糖、麥芽糖和果糖為C源的黑皮雞樅菌絲生長速度，且菌絲生長較整齊、濃密、健壯。因此，選取葡萄糖為黑皮雞樅菌絲培養(yǎng)的最適C源。

2. 1. 2 不同N源對黑皮雞樅菌絲生長的影響 由表4可知，不同N源培養(yǎng)的黑皮雞樅菌絲長勢存在差異，生長速度間差異顯著，其中以高粱粉為N源的黑皮雞樅菌絲生長速度為0.45 cm/d，顯著快于以玉米粉、大米粉和黃豆粉為N源的黑皮雞樅菌絲生長速度，且菌絲長勢最強;以玉米粉為N源的黑皮雞樅菌絲生長不整齊、菌絲稀疏細弱，生長速度最慢。因此，選取高粱粉為黑皮雞樅菌絲培養(yǎng)的最適N源。

2. 1. 3 不同C/N對黑皮雞樅菌絲生長的影響 由表5可知，不同C/N的黑皮雞樅菌絲鮮重存在差異，其中5號培養(yǎng)基的菌絲鮮重最重，達32.38 g/100 mL，因此最適宜黑皮雞樅菌絲生長的C/N為5∶1，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖和高粱粉的添加量分別為20.0和4.0 g，黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組成為20.0 g葡萄糖、4.0 g高粱粉、3.0 g K2HPO4、1.0 g MgSO4和2片維生素B1。

2. 2 黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵工藝的優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 發(fā)酵罐接種量的優(yōu)化 由表6可知，各接種量黑皮雞樅菌絲的漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性間均存在顯著差異。其中，接種量為12%時，菌球直徑最大，為0.85 cm，且大小均勻，其漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性均顯著高于其他接種量處理。因此，黑皮雞樅菌絲生長的發(fā)酵罐最適接種量為液體搖瓶裝液量的12%。

2. 2. 2 發(fā)酵罐裝液量的優(yōu)化 由表7可知，各發(fā)酵罐裝液量黑皮雞樅菌絲的漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性間均存在顯著差異。其中，裝液量為12 L時，菌絲的生物量（菌絲體干重）最大，為2.907 g/100 mL，其漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性均顯著高于其他裝液量處理。因此，黑皮雞樅菌絲生長的發(fā)酵罐培養(yǎng)最適裝液量為12 L。

2. 2. 3 發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 由表8可知，發(fā)酵罐不同培養(yǎng)溫度下黑皮雞樅菌絲的漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性間均存在顯著差異。其中，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為25 ℃時，菌絲體生長最快，菌球直徑最大，為0.89 cm，且菌絲體干重最重，其漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性均顯著高于其他發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度處理。因此，黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)最適溫度為25 ℃。

2. 2. 4 發(fā)酵罐培養(yǎng)時間的優(yōu)化 由表9可知，各發(fā)酵罐培養(yǎng)時間黑皮雞樅菌絲的漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性間均存在顯著差異。其中，發(fā)酵罐培養(yǎng)時間為100 h時，菌球直徑最大，菌絲體干重最重，其漆酶活性、纖維素酶活性和多酚氧化酶活性均顯著高于其他發(fā)酵罐培養(yǎng)時間處理。因此，黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)最適時間為100 h。

2. 3 栽培試驗結(jié)果

在無菌接種室內(nèi)將發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的液體菌種注入栽培袋中進行出菇培養(yǎng)，結(jié)果在最佳工藝條件下培養(yǎng)的菌種菌絲生長速度快，菌絲長滿18 cm×36 cm聚丙烯塑料袋時間為29 d，子實體單生，直立，暗褐色，鮮嫩醇香，平均每袋產(chǎn)量約360.0 g，生物學轉(zhuǎn)化率達78.0%（圖1和圖2）。說明該液體菌種可在生產(chǎn)中推廣應用。

3 討論

目前關(guān)于食用菌液體菌種研究的報道很多，已應用于生產(chǎn)的品種有茯苓、側(cè)耳、金針菇、香菇、黑木耳、猴頭菇和靈芝等。通過發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的液體菌種具有生產(chǎn)周期短、成本低、菌齡一致、純度高、接種簡便、不受季節(jié)限制、可連續(xù)自動化生產(chǎn)和提高食用菌生物轉(zhuǎn)化率等優(yōu)點（戴建清和曾志恒，2012;郭尚和王慧娟，2013），但制備食用菌發(fā)酵罐液體菌種對生產(chǎn)工藝和技術(shù)條件要求較高，因此我國現(xiàn)有的規(guī)模化食用菌工廠化生產(chǎn)企業(yè)大部分仍以固體菌種為主，發(fā)酵罐液體菌種僅用于杏鮑菇、金針菇和蟹味菇等工廠化品種的生產(chǎn)。

蘇躍穩(wěn)等（2016）研究認為，培養(yǎng)基、接種量、接種時間、溫度、pH和通氣量等因素是液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。聶曉東（2009）通過對搖瓶進行放大試驗，在5 L發(fā)酵罐水平上得到雞樅菌的培養(yǎng)條件為：接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速80 r/min、裝液量3 L、溫度28 ℃和pH 4.0，在此條件下雞樅菌的生物量達最大值。本研究在15 L發(fā)酵罐水平上得到黑皮雞樅菌優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：接種量12%、搖床轉(zhuǎn)速90 r/min、裝液量12 L、溫度25 ℃和pH 6.5，與聶曉東（2009）的研究結(jié)果存在差異，可能與研究的雞樅菌種屬不同、選用的C源和N源不同有關(guān)。

真菌菌絲體在發(fā)酵培養(yǎng)過程中會向外分泌多種胞外酶如木質(zhì)素酶、半纖維素酶、纖維素酶、漆酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶等（王謙和胡衛(wèi)靜，2016）。目前，有關(guān)食用菌液體發(fā)酵生理指標檢測的研究報道甚少，不同的培養(yǎng)條件對菌絲生長和多種酶活性的影響差異明顯。本研究通過對黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵過程中的菌球數(shù)量、pH、纖維素酶活性、漆酶活性、多酚氧化酶活性等影響菌絲生長的生理指標進行測定，可有效監(jiān)測黑皮雞樅液體菌種的制備過程，為液體菌種活性評價提供參考依據(jù)，也可為進行100、500和1000 L等發(fā)酵罐的逐級擴大生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

通過15 L發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化，獲得黑皮雞樅液體菌種發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為20.0 g葡萄糖+4.0 g高粱粉+3.0 g K2HPO4+1.0 g MgSO4+2片維生素B1+1000.0 mL蒸餾水，pH 6.5;發(fā)酵工藝為：裝液量12 L，接種量12%，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速90 r/min，培養(yǎng)時間100 h，罐壓0.3 MPa，通氣量0.9 m3/h。在此優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝下將黑皮雞樅液體菌種接種于栽培袋，生物學轉(zhuǎn)化率達78.0%?？梢?，將液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)與工廠化栽培技術(shù)有機結(jié)合，可實現(xiàn)黑皮雞樅菌的規(guī)?；?、標準化、現(xiàn)代化和工廠化生產(chǎn)。

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（責任編輯 思利華）