周生輝

[摘要]目的：分析Daxx基因在小鼠睪丸精子發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)。方法：對(duì)不同周齡的野生小鼠的睪丸組織、成年睪丸支持細(xì)胞的雄激素受體特異性敲除（SCARKO）以及其雄性激素受體的敲除（ARKO）小鼠睪丸的水平進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果：SCARKO小鼠和野生型的小鼠相比較其睪丸中Daxx基因的表達(dá)沒(méi)有明顯不同，然而在生精細(xì)胞的細(xì)胞核當(dāng)中呈現(xiàn)極性分布的情況，在ARKO小鼠的睪丸Daxx基因的表達(dá)與其他方法相比明顯降低。結(jié)論：ARKO的小鼠與野生型小鼠相比其Daxx基因的表達(dá)明顯降低，Daxx基因的定位情況受到睪丸支持細(xì)胞中AR基因的特異性敲除的作用。小鼠睪丸精子的發(fā)生過(guò)程可能有Daxx基因的參與。

[關(guān)鍵詞]Daxx基因;實(shí)驗(yàn)小鼠;睪丸;精子

[中圖分類號(hào)]R321 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2019）21-0011-02

在精子的發(fā)生過(guò)程中雄激素以及受體（AR）有及其重要的影響Ⅲ。精子不能正常發(fā)揮作用以及男性造成的不育狀況與雄激素的低水平或AR基因突變情況有直接關(guān)系，睪丸的組織不相同細(xì)胞類型的條件性AR基因敲除以至于小鼠呈現(xiàn)各種情況的生精障礙。睪丸支持細(xì)胞中的AR調(diào)節(jié)精子的發(fā)生受到雄激素作用的影響。相關(guān)研究人員通過(guò)使用二代測(cè)序的方法，對(duì)SCARKO小鼠和野生型的小鼠睪丸的表達(dá)進(jìn)行詳細(xì)的對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在一系列的基因差異表達(dá)情況。對(duì)于AR敲除后的死亡結(jié)構(gòu)域的相關(guān)蛋白其表達(dá)顯著降低。Daxx基因最終能夠進(jìn)入細(xì)胞核，而后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)最終使細(xì)胞凋亡。Daxx蛋白表現(xiàn)出來(lái)的高表達(dá)情況說(shuō)明其影響睪丸的生精作用，值得對(duì)睪丸生理方面的深入探究。

1資料和方法

1.1材料的準(zhǔn)備準(zhǔn)備1、2、3、4、6、8周的野生型小鼠各4只，經(jīng)處死后將其睪丸的總RNA提取出來(lái)。8周的小鼠、ARKO和SCARKO小鼠各準(zhǔn)備4只，取其膀胱、脾、心、腎、肝、肺、腦、睪丸、附睪的總RNA和總蛋白，將睪丸組織進(jìn)行固定。

1.2提取反轉(zhuǎn)錄PCtL采用0.8%的瓊脂糖電泳檢驗(yàn)RNA完整程度。將RNA進(jìn)行定量操作后取1ug并參照說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。將Cdna提取后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括10uL的PCR、8uL的雙蒸水、1uL的Cdna以及各0.5uL的引物，總為20uL。PCR擴(kuò)增在98℃兩min的預(yù)變性，98℃的10s鐘的變性，60℃的30s退火，72℃的20s的延伸總計(jì)為35個(gè)循環(huán)過(guò)程，在72℃下延伸5min，在4℃下進(jìn)行冷卻，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢驗(yàn)采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

1.3通過(guò)熒光定量?jī)x對(duì)qPCR進(jìn)行檢驗(yàn)反應(yīng)體系中有10uL的TaqⅡPCR，1uL的cDNA，8uL的DEPC H20，0.5uL的上下游引物。在95℃下30s，95℃下5s，60℃下30s，72℃下15s，一共為40個(gè)循環(huán)過(guò)程。內(nèi)參為GAPDH。

1.4Western印跡蛋白質(zhì)的濃度大小通過(guò)BCA方法進(jìn)行測(cè)定，將濃度定為1微克/uL，將5倍的上樣緩沖液加入其中，在98℃下進(jìn)行5min。然后通過(guò)常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜和5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉處理，將一抗加入經(jīng)過(guò)一夜。采用TBST清洗重復(fù)3次，每次清洗5min，將二抗加入進(jìn)行1小時(shí)的室溫培育，清洗方法同上，ECL發(fā)光液體在培育后曝光。室溫保存直至晾干然后掃描獲取結(jié)果。

1.5免疫組化以及細(xì)胞免疫熒光染色將石蠟包裹的睪丸組織切成厚度為3微米的片狀，并干燥后備用。一次經(jīng)過(guò)二甲苯、乙醇水、枸櫞酸處理，冷卻達(dá)到室溫，采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%的Trion x-100進(jìn)行十min的打孔操作。精原細(xì)胞爬片之后，清洗并固定，將切片或爬片在室溫下封閉保存1小時(shí)，一抗在4℃下經(jīng)過(guò)一晚，1gG熒光二抗在室溫下培育兩小時(shí)，染核后用熒光防猝滅劑封閉樣品片，觀察熒光狀態(tài)。采用1gG代替一抗進(jìn)行陰性比較。

1.6培養(yǎng)細(xì)胞在5%的二氧化碳，溫度為37℃的條件下培養(yǎng)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料（x±s）表示，通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，使用計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)病例數(shù)（n，%），并進(jìn)行x檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同周齡的野生型小鼠其Daxx基因在睪丸中的表達(dá)2周的小鼠Daxx基因表達(dá)處于較低水平，3周的小鼠表達(dá)升高，mRNA在其性成熟時(shí)表達(dá)水平為最高。2周的小鼠其蛋白水平表達(dá)較低，與mRNA相類似。4周達(dá)到最高，6、8周開(kāi)始降低，但相差不顯著。

2.2AR.KO、SCARKO小鼠與野生小鼠睪丸中Daxx基因的表達(dá)情況對(duì)比SCARKO小鼠的睪丸中mRNA與蛋白的表達(dá)水平與野生小鼠相比沒(méi)有明顯的不同，ARKO的小鼠mRNA與蛋白的水平明顯下降。

2.3Daxx在1周和2周的熒光強(qiáng)度比較弱，到3周增強(qiáng)，4周表現(xiàn)最強(qiáng)，6、8周的熒光強(qiáng)度與4周相比沒(méi)有明顯不同。4周的生精細(xì)胞經(jīng)研究表現(xiàn)出核極性的表達(dá)。

2.4野生型成年小鼠的Daxx的熒光強(qiáng)度集中于細(xì)胞核，SCARKO小鼠的熒光強(qiáng)度比較強(qiáng)，表現(xiàn)出細(xì)胞核極性表達(dá)情況，ARKO小鼠的熒光強(qiáng)度比較弱，定位無(wú)法確定。

2.5Daxx表現(xiàn)于精原細(xì)胞的細(xì)胞核部位。

3討論

SCARKO和ARKO的生精過(guò)程分別在精母細(xì)胞減數(shù)分裂的細(xì)線期和粗線期停止，特異性AR敲除小鼠與野生型小鼠沒(méi)有顯著的不同。支持細(xì)胞中AR基因的特異性敲除和全身性的AR基因敲除有相似的阻礙精子發(fā)生的情況，精子發(fā)生也與支持細(xì)胞有重要關(guān)系。AR的主要表達(dá)部位為睪丸的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管壁以及肌樣細(xì)胞。有專家發(fā)現(xiàn)SCARKO與野生型小鼠的睪丸在Daxx表達(dá)上有顯著差異。這一系列研究為精子被阻礙造成男性不育提供臨床診療根據(jù)。

在本次研究過(guò)程中，2、3周的小鼠Daxx基因的表達(dá)從較低變?yōu)樯撸?周的小鼠為最高，6，8周的小鼠又開(kāi)始下降，但與4周的相比沒(méi)有明顯的不同。SCARKO小鼠的睪丸中mRNA與蛋白的表達(dá)水平與野生小鼠相比沒(méi)有明顯的不同，ARKO的小鼠mRNA與蛋白的水平明顯下降。Daxx在1周和2周的熒光強(qiáng)度比較弱，到3周增強(qiáng)，4周表現(xiàn)最強(qiáng)，6、8周的熒光強(qiáng)度與4周相比沒(méi)有明顯不同。野生型成年小鼠的Daxx的熒光強(qiáng)度集中于細(xì)胞核，SCARKO小鼠的熒光強(qiáng)度比較強(qiáng)，表現(xiàn)出細(xì)胞核極性表達(dá)情況，ARKO小鼠的熒光強(qiáng)度比較弱，定位無(wú)法確定。Daxx表現(xiàn)于精原細(xì)胞的細(xì)胞核部位。

綜上所述，本次研究探究了Daxx基因在小鼠睪丸精子發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸精子的發(fā)生過(guò)程存在Daxx蛋白的調(diào)節(jié)和控制的參與，并深入觀察了Daxx的作用，為臨床上治療男性不育癥狀提供診療依據(jù)。