季艷麗　程云偉　陳發(fā)菊　張德春　周超

摘要：? 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中伴隨著復(fù)雜的生理生化變化，為進(jìn)一步揭示胚性愈傷組織的再生潛力，該研究以高粱Sb19未成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的兩種胚性愈傷組織和一種非胚性愈傷組織為材料，通過測定各愈傷組織中可溶性蛋白、游離脯氨酸和可溶性糖的含量，采用方差分析法對高粱體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中不同類型愈傷組織的生理生化指標(biāo)進(jìn)行了差異比較研究。結(jié)果表明：（1）高粱兩種胚性愈傷組織中可溶性蛋白、游離脯氨酸和可溶性糖的含量均顯著高于非胚性愈傷組織，表明胚性愈傷組織中的代謝活性高于非胚性愈傷組織，能夠?yàn)轶w細(xì)胞胚胎發(fā)生提供更多的物質(zhì)能量基礎(chǔ)。（2）兩種類型胚性愈傷組織之間生理生化差異顯著，其中，Ⅱ型胚性愈傷組織中可溶性蛋白和游離脯氨酸含量均顯著高于I型胚性愈傷組織，相反，Ⅱ型胚性愈傷組織中可溶性糖含量顯著低于I型胚性愈傷組織，這種生理生化差異在一定程度上影響了后期的分化。該研究結(jié)果為愈傷組織的胚胎發(fā)生能力與生化代謝的關(guān)系提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 高粱， 胚性愈傷組織， 非胚性愈傷組織， 可溶性蛋白， 游離脯氨酸， 可溶性糖

中圖分類號：? Q945.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）12-1613-06

作者簡介： 季艷麗（1994-），女，湖北隨州人，碩士研究生，主要從事植物遺傳育種與發(fā)育研究，（E-mail）1975891532@qq.com。

Abstract：? There are complex physiological and biochemical changes in the process of plant somatic embryogenesis. In order to reveal the regenerative potential of embryogenic callus， we determined the content of soluble protein， free proline and soluble sugar in two kinds of embryogenic calluses and a non-embryonic callus which were from the induction of Sb19 Sorghum bicolor immature embryos. The differences of physiological and biochemical parameters between different types of callus in S. bicolor somatic embryogenesis were compared by variance analysis. The results were as follows： （1） The contents of soluble protein， free proline and soluble sugar in two kinds of embryogenic callus were significantly higher than that of non-embryogenic callus， which indicates that the metabolic activity in embryogenic callus is higher than that in non-embryonic callus， and embryogenic callus can provide more material energy basis for somatic embryogenesis. （2） The physiological and biochemical differences between the two types of embryogenic callus were also significant. Among them， the contents of soluble protein and free proline in Type Ⅱ embryogenic callus were significantly higher than that of Type I embryogenic callus. In contrast， the content of soluble sugar in Type Ⅱ embryogenic callus was significantly lower than that of Type I embryogenic callus. We draw a conclusion that the differences of physiological and biochemical affect the differentiation on a certain degree. This study provides a theoretical basis for the relationship between embryogenic ability and biochemical metabolism of callus.

Key words： Sorghum bicolor， embryogenic callus， non-embryonic callus， soluble protein， free proline， soluble sugar

高粱（Sorghum bicolor）是世界上五大谷類作物之一，具有較強(qiáng)的耐旱性，能夠較好地適應(yīng)半干旱氣候，具有比玉米更高的水利用效率（Roby et al.， 2017），在食品保障和可再生能源開發(fā)中發(fā)揮著獨(dú)特的作用（Mullet et al.， 2014; De et al.， 2017）。目前，全球糧食、能源危機(jī)日益嚴(yán)重，發(fā)展高粱生產(chǎn)，將有助于緩解這些危機(jī)。建立高效的高粱再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系是高粱分子育種的基礎(chǔ)。但是，高粱體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前面臨的最大問題就是胚性愈傷組織再生能力的保持，其次是基因型和褐化問題。近年來，關(guān)于高粱愈傷組織繼代培養(yǎng)后再生能力下降的研究多有報(bào)道（Liu et al.， 2015; Li et al.， 2017），但是未見對其再生率下降機(jī)理的研究。同時，在對其他禾本科植物如水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織形態(tài)逐漸由胚性向非胚性轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致愈傷組織胚性的喪失（都曉龍等，2016）。因此，如何使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫吲咝阅芰Φ募?xì)胞是保持愈傷組織分化能力的關(guān)鍵。

植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中伴隨著復(fù)雜的生理變化。其中，蛋白質(zhì)是胚胎發(fā)育的重要代謝物組之一，在胚胎發(fā)生初期激活細(xì)胞代謝以建立胚胎發(fā)生能力（Cangahuala-Inocente et al.， 2014）。王慧純等（2017）發(fā)現(xiàn)連香樹胚性愈傷組織中可溶性蛋白含量顯著高于非胚性愈傷組織，并表明胚性愈傷組織蛋白質(zhì)的積累為體胚發(fā)生提供物質(zhì)基礎(chǔ)。脯氨酸在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和分化中起重要作用（Nanjo et al.， 1999）。孟姣等（2015）報(bào)道栓皮櫟胚性愈傷組織中游離脯氨酸含量均顯著高于非胚性愈傷組織，表明了脯氨酸在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的重要性?？扇苄蕴窃谂咛グl(fā)育早期也具有重要作用，它不僅為細(xì)胞發(fā)育提供能源物質(zhì)，構(gòu)成碳骨架，而且具有信號傳導(dǎo)的功能（趙江濤等，2006）。李華（2010）對珍珠黃楊的研究顯示，胚性愈傷組織中可溶性糖含量高于非胚性愈傷組織，并表明可溶性糖能夠?yàn)轶w細(xì)胞胚胎的發(fā)生提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，探究高粱胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織生理生化差異對高粱體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的研究具有重要意義。

本研究以高粱 Sb19未成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的兩種胚性愈傷組織和一種非胚性愈傷組織為材料，測定不同愈傷組織中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量，分析高粱兩種胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織生理生化特性的差異，以期為愈傷組織的胚胎發(fā)生能力與生化代謝的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

參考彭祥（2018）的方法，采集Sb19花后14 d的未成熟種子，經(jīng)消毒后將未成熟胚剝離出來，將未成熟胚正面朝上放置在含1.0 mL·L-1 B5有機(jī)質(zhì)、1.0 g·L-1 L-Pro、1.0 g·L-1 Asn、1.0 g·L-1 KH2PO4、1.0 g·L-1 PVP、2.5 mg·L-1 CuSO4·5H2O、2.0 mg·L-1 2，4-D、30.0 g·L-1蔗糖和8 g·L-1瓊脂，pH為5.8的MS培養(yǎng)基上，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)30 d后， 得到三種愈傷組織（圖1）。其中，注： A. I型胚性愈傷組織; B. Ⅱ型胚性愈傷組織; C. 非胚性愈傷組織。

I型胚性愈傷組織呈黃色，色澤鮮艷，呈細(xì)胞團(tuán)狀;Ⅱ型胚性愈傷組織呈白色顆粒或褶皺狀，質(zhì)地較硬;非胚性愈傷組織呈透明、水漬狀，質(zhì)地稀軟。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白含量的測定愈傷組織中可溶性蛋白的提取：稱取0.30 g的愈傷組織鮮樣，用5 mL蒸餾水研磨成勻漿，于25 mL容量瓶中定容，放置30 min以充分提取，離心，上清液即為樣品的蛋白提取液。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法（王孝平和邢樹禮，2009）測定各愈傷組織提取液中可溶性蛋白的含量。

1.2.2 游離脯氨酸含量的測定愈傷組織中游離脯氨酸的提?。悍Q取0.3 g的愈傷組織鮮樣，加5 mL 3%的磺基水楊酸溶液，沸水浴中提取10 min，提取時要時常搖動，冷卻后過濾，濾液即為樣品的脯氨酸提取液。采用酸性茚三酮法（王學(xué)奎，2006）測定各愈傷組織提取液中游離脯氨酸的含量。

1.2.3 可溶性糖含量的測定愈傷組織中可溶性糖的提?。悍Q取0.3 g的愈傷組織鮮樣，用1 mL水研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入試管中，并用5 mL蒸餾水分次洗滌，洗滌液轉(zhuǎn)入試管中，沸浴提取10 min，冷卻后過濾，將濾液定容于50 mL容量瓶中，即為樣品的可溶性糖提取液。采用蒽酮比色法（丁雪梅等，2014）測定各愈傷組織提取液中可溶性糖的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組樣品重復(fù)取樣3次，使用Excel 2010計(jì)算各指標(biāo)含量，在SPSS19.0中采用單因素ANOVA法分析不同愈傷組織生理指標(biāo)的差異，并采用 Duncan 法進(jìn)行多重比較，使用Origin 9.0作圖。檢驗(yàn)顯著性概率設(shè)置為α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白含量的差異

植物的可溶性蛋白中大部分是具有特異性作用的酶類，是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其含量是了解植物細(xì)胞總代謝的一個重要指標(biāo)，其積累與胚胎發(fā)育有關(guān)（Jiménez， 2001）。高粱不同類型胚性和非胚性愈傷組織可溶性蛋白含量的差異較大（圖2），高粱兩種胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量均顯著高于非胚性愈傷組織，且Ⅱ型胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量顯著高于I型胚性愈傷組織。

2.2 游離脯氨酸含量的差異

游離脯氨酸是細(xì)胞質(zhì)中滲透調(diào)節(jié)的重要有機(jī)溶質(zhì)，即使在沒有應(yīng)激情況下，對細(xì)胞形態(tài)和分化的調(diào)節(jié)也起重要的作用（Nanjo et al.， 1999）。高粱不同類型胚性和非胚性愈傷組織游離脯氨酸含量的差異較大（圖3），兩種胚性愈傷組織的游離脯氨酸含量均顯著高于非胚性愈傷組織，且Ⅱ型胚性愈傷組織的游離脯氨酸含量顯著高于I型胚性愈傷組織。

可溶性糖在植物胚胎發(fā)育的早期階段具有重要作用，是碳骨架合成和信號傳導(dǎo)的主要能量來源（趙江濤等， 2006）。高粱不同類型胚性和非胚性愈傷組織可溶性糖含量的差異較大（圖4），兩種胚性愈傷組織的可溶性糖含量均顯著高于非胚性愈傷組織，且I型胚性愈傷組織的可溶性糖含量顯著高于Ⅱ型胚性愈傷組織。

3討論與結(jié)論

體細(xì)胞胚胎發(fā)生的實(shí)質(zhì)是基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果，蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，因此在體胚發(fā)生過程中必然伴隨著蛋白質(zhì)含量的變化（崔凱榮等，2001）。高粱兩種胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量均顯著高于非胚性愈傷組織，說明高粱胚性愈傷組織代謝活動旺盛，高含量的可溶性蛋白能夠?yàn)榕咝约?xì)胞的分化奠定分子基礎(chǔ)。趙舒野（2013）對胡桃楸體細(xì)胞胚發(fā)生過程生理生化特性的研究發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織中的可溶性蛋白和可溶性糖含量始終高于非胚性愈傷組織，并表明胚性愈傷組織代謝較旺盛，能夠從培養(yǎng)基中獲得營養(yǎng)物質(zhì)并積累，從而為后期分化做準(zhǔn)備。

胚性愈傷組織中游離脯氨酸的積累與體細(xì)胞胚胎發(fā)生有重要聯(lián)系（Fatima et al.， 2011）。高粱兩種胚性愈傷組織游離脯氨酸含量均顯著高于非胚性愈傷組織，說明愈傷組織中游離脯氨酸含量的高低可能會影響組織分化。張永華等（2007）在對番茄花藥組織培養(yǎng)的研究中也表明游離脯氨酸含量與苗分化有關(guān)。孫政等（2017）研究了楸樹胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的生理生化差異，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織中游離脯氨酸含量高于非胚性愈傷組織，并表明具有較高含量游離脯氨酸的愈傷組織其體胚發(fā)生能力也較強(qiáng)。

可溶性糖是植物胚胎發(fā)育過程中的主要能量來源（Pescador et al.， 2008），能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)的合成提供能源物質(zhì)（孫政等，2017）。高粱兩種胚性愈傷組織可溶性糖含量均顯著高于非胚性愈傷組織，說明高粱胚性愈傷組織代謝速率高于非胚性愈傷組織，為后期的分化提供能源物質(zhì)。鄒玉霞等（2018）在對瘤毛獐牙菜愈傷組織生理生化差異的研究中發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織中的可溶性糖含量是非胚性愈傷組織的2.5倍，表明高含量的可溶性糖和可溶性蛋白能夠?yàn)楹笃诩?xì)胞分化做準(zhǔn)備。

高梁兩種胚性愈傷組織的生理生化指標(biāo)均有差異。其中，I型胚性愈傷組織的可溶性蛋白和游離脯氨酸含量顯著低于Ⅱ型胚性愈傷組織，而可溶性糖含量顯著高于Ⅱ型胚性愈傷組織。彭祥（2018）對這兩種胚性愈傷組織的研究發(fā)現(xiàn)，I型胚性愈傷組織易分化成根，Ⅱ型胚性愈傷組織易分化成苗。我們認(rèn)為兩種愈傷組織生理生化的差異一定程度上影響了后續(xù)的分化。王海波和范云六（2006）在對小麥的組織培養(yǎng)中表明，可以通過控制外源因子（如培養(yǎng)基、溫度、光照等），對培養(yǎng)物生理生化過程進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響愈傷組織狀態(tài)。因此，我們是否可以通過跟蹤愈傷組織中生理生化的變化，對愈傷組織狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控使其能夠?qū)崿F(xiàn)長期繼代而不喪失分化能力，這值得我們進(jìn)一步探討。

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