王鵬良　吳雙成　楊利平　王華宇　陳乃明　張照遠(yuǎn)

摘要：? 該文針對(duì)巨桉葉綠體基因組序列，選取其中長(zhǎng)于300 nt且以AUG為起始密碼子的43個(gè)非重復(fù)基因作為研究對(duì)象，采用CodonW1.4.2軟件分析巨桉葉綠體基因組的密碼子使用偏好性。結(jié)果表明：第3位密碼子的平均GC含量為27.97%;ENC的變化范圍為39.49～61.00，平均為47.04;RSCU>1的密碼子有31個(gè)，其中29個(gè)以A/U結(jié)尾;中性分析顯示，GC12與GC3無(wú)顯著相關(guān);回歸分析未達(dá)到顯著性水平;ENC-plot分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因落在曲線上或附近;對(duì)應(yīng)分析表明第1軸的貢獻(xiàn)率為17.68%，第2軸的貢獻(xiàn)率為11.49%，第3軸、第4軸的貢獻(xiàn)率分別為8.00%和5.76%，前4軸累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)42.93%，第1軸與GC、ENC、CAI達(dá)到極顯著相關(guān)。上述分析結(jié)果表明，巨桉葉綠體基因組的密碼子偏好較弱，密碼子第3位偏好以A或U結(jié)尾，選擇和突變?cè)诰掼袢~綠體基因組密碼子偏好中起相對(duì)均衡的作用，最終確定UUG、CUU、GUU、UCC、UCA、ACA、UAU、UAA、CAU、AAU、AGA和GGA 12個(gè)高頻高表達(dá)密碼子為最優(yōu)密碼子。這為轉(zhuǎn)化葉綠體基因密碼子優(yōu)化，提高表達(dá)效率和改良巨桉目標(biāo)性狀奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 巨桉， 葉綠體， 基因組， 密碼子偏好性

中圖分類號(hào)：? Q945.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2019）12-1583-10

作者簡(jiǎn)介： 王鵬良（1978-），男，浙江新昌人，博士，高級(jí)工程師，主要從事植物遺傳育種研究，（Email）pengliang_wang@163.com， pengliang_wang@qzhu.edu.cn。

Abstract：? In this study， analysis of codon bias was carried out using CodonW 1.4.2 software， with chloroplast genome of Eucalyptus grandis as material and 43 nonrepeated genes beginning with AUG as objects. The results showed that the average GC content in the 3rd position was 27.97%; ENC ranged from 39.49 to 61.00 with an average of 47.04; there were 31 codons whose RSCU were more than 1.00 in the chloroplast genome; of which， 29 codons ended with A/U; neutral plot analysis showed correction and regression analysis between GC12 and GC3 were not significant; ENCplot revealed most genes were located along or near the standard curve; correspondence analysis indicated the 1st axis accounted for 17.68% contribution， the 2nd axis 11.49%， the rest axes accounted for 8.00% and 5.76% and the first four axes accounted for 42.93% in total; the correction between the 1st axis and the parameters such as GC， ENC and CAI was extremely significant.? The results mentioned above revealed that the codon bias level was low in the chloroplast genome and the 3 rd codons always end with A/U and codon bias might be determined by both mutation and selection nearly equally. Finally， twelve codons that were not only highly expressed but frequently were determined as the optimal codons including UUG， CUU， GUU， UCC， UCA， ACA， UAU， UAA， CAU， AAU， AGA and GGA. This study will provide a solid foundation for codon optimization of the genes transformed into chloroplast genome and future increasing the expression efficiency for improvement of important traits.

Key words： Eucalyptus grandis， chloroplast， genome， codon bias

巨桉（Eucalyptus grandis）原產(chǎn)于澳大利亞，為桃金娘科桉屬中的一個(gè)多年生木本樹種。因其生長(zhǎng)迅速、樹形通直、樹體高大，巨桉被引種至世界各地廣泛種植，成為各國(guó)重要的外來(lái)樹種（陳少雄等，2018）。因此，研究人員在引種馴化的基礎(chǔ)上開(kāi)展了種源/家系/單株不同性狀變異研究。前人結(jié)果表明，巨桉的抗寒性不足（劉建等， 2009），易受癭姬小蜂感染（張照遠(yuǎn)等，2016），不同遺傳資源在生長(zhǎng)和形質(zhì)方面也存在較大差異（吳世軍等， 2016）。

基因工程技術(shù)育種與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比具有針對(duì)性強(qiáng)、周期短、效率高等明顯優(yōu)勢(shì)（王關(guān)林和方宏筠， 2014）。葉綠體基因工程具有明顯的高效表達(dá)，并能有效控制轉(zhuǎn)化基因的擴(kuò)散等特點(diǎn)，是極為理想的轉(zhuǎn)化方式（Daniell & Chase， 2004）。密碼子被稱為第二套遺傳密碼（Nelson & Cox， 2017; Hanson & Coller， 2018）;密碼子使用的選擇不僅影響基因的表達(dá)（Zhou et al.， 2016），也影響基因相應(yīng)的功能（Hershberg & Petrov， 2008）。不同物種間葉綠體基因組的密碼子偏好存在較大差異（Zhou et al.， 2008; 王鵬良等， 2018）。本文旨在分析巨桉葉綠體基因組密碼子偏好性的特征，并確定其最優(yōu)密碼子，為巨桉葉綠體基因工程的開(kāi)展和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 序列

從NCBI網(wǎng)站的細(xì)胞器基因組網(wǎng)頁(yè)中搜索巨桉的拉丁名Eucalyptus grandis找到巨桉的葉綠體基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_014570.1），下載其Fasta格式的全基因組和基因編碼序列（coding sequences）。巨桉葉綠體基因組總長(zhǎng)為160 137 bp，共含有75個(gè)基因。為了降低誤差，本文選用其中以AUG為起始密碼子且長(zhǎng)度超過(guò)300 nt的43條非重復(fù)序列用于密碼子偏好性分析。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1 密碼子偏好參數(shù)計(jì)算 以所選的43個(gè)非重復(fù)基因的編碼序列為對(duì)象，采用CodonW1.4.2軟件分析密碼子偏好參數(shù)：同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU， relative synonymous codon usage）、有效密碼子數(shù)目（ENC， effective number of codon）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI， codon adaption index）、密碼子偏好性指數(shù)（CBI， codon bias index）、最優(yōu)密碼子使用頻率（FOP， frequency of optimal codons），該基因表達(dá)為蛋白質(zhì)的疏水性（Gravy）及不同位置的GC含量。其中，有效密碼子數(shù)目最小理論值為20，說(shuō)明每個(gè)氨基酸都只有一個(gè)密碼子，最大理論值為61，說(shuō)明所有密碼子都均等使用;密碼子適應(yīng)指數(shù)，變化范圍為0Symbol～A@1，值越大偏性越強(qiáng);不同位置的GC含量，包括GC1、GC2、GC3、GC3S、GC12和GC，分別代表密碼子中第1位、第2位、第3位的GC含量，第3位同義密碼子GC含量，第1位、第2位密碼子平均GC含量和密碼子總體的GC含量。

1.2.2 中性繪圖分析 為了初步確定影響密碼子偏好的因素，中性繪圖分析根據(jù)GC1和GC2的信息計(jì)算兩者的平均值GC12作為縱坐標(biāo)，以GC3為橫坐標(biāo)，以散點(diǎn)圖的形式在坐標(biāo)中定位各基因的位置，根據(jù)基因的坐標(biāo)信息與坐標(biāo)對(duì)角線的關(guān)系，若基因位于對(duì)角線上，則表明基因受突變作用;若基因不位于對(duì)角線，則表明該基因收到選擇的影響，從而判斷造成密碼子的使用偏好的因素。

1.2.3 ENC-plot繪圖 為了進(jìn)一步確定影響密碼子偏好的因素，ENC-plot繪圖以ENC為縱坐標(biāo)，以GC3S為橫坐標(biāo)建立坐標(biāo)系，先將各基因定位在該坐標(biāo)中形成散點(diǎn)圖。再在坐標(biāo)系中添加ENC的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（Wright， 1990）：

根據(jù)散點(diǎn)圖和ENC比值的分布結(jié)果，若偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，則表明受到選擇作用;若在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，則只是受到突變作用，從而推斷造成密碼子偏好的可能原因。

1.2.4 對(duì)應(yīng)分析 對(duì)應(yīng)分析是一種對(duì)原始數(shù)據(jù)采用適當(dāng)?shù)臉?biāo)度方法，將變量和樣本分析結(jié)合起來(lái)，同時(shí)得到兩方面的結(jié)果，在同一因子平面上對(duì)變量和樣本一起進(jìn)行分類，從而揭示樣本和變量間的內(nèi)在聯(lián)系。利用CodonW軟件將對(duì)應(yīng)分析用于巨桉葉綠體基因組密碼子分析，從而揭示巨桉葉綠體基因組密碼子使用的規(guī)律。

1.2.5 最優(yōu)密碼子的確定 為了確定最優(yōu)密碼子，以ENC參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有參試基因按照從大到小的順序排列，分別從ENC最高和最低兩端都選取所有參試基因的10%，建立高表達(dá)和低表達(dá)庫(kù)。

將高表達(dá)庫(kù)與低表達(dá)庫(kù)的同義密碼子相對(duì)使用度的差值（ΔRSCU）高于0.08且同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）高于1的密碼子確定為最優(yōu)密碼子（李娟和薛慶中， 2005; 續(xù)晨等， 2010; 楊國(guó)鋒等， 2015; 王鵬良等， 2018）。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成分析

為了更加準(zhǔn)確分析密碼子偏好性，本研究選取了巨桉葉綠體基因組中以AUG為起始密碼子且編碼區(qū)序列長(zhǎng)度超過(guò)300 nt的43個(gè)非重復(fù)基因的編碼序列為研究對(duì)象，采用CodonW軟件對(duì)參試基因開(kāi)展密碼子相關(guān)參數(shù)的計(jì)算和分析。由表1可知，不同基因密碼子不同位置的GC含量并不相同，第1位、第2位、第3位密碼子的GC含量的變化范圍分別為34.20%～58.90%、27.90%～58.70%、20.20%～37.00%，其平均值分別為47.40%、39.47%、27.97%，且第1位、第2位的GC含量明顯高于第3位;ENC的范圍在39.49～61.00之間，平均值為47.04;CAI的范圍為0.082～0.301，平均值為0.171 4;CBI的范圍為-0.222～0.196，平均值為-0.092;FOP的范圍為0.263～0.532，平均值為0.356;蛋白質(zhì)的Gravy變化范圍為-0.704～1.102，平均值為0.017。

密碼子參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果（表2）表明：GC1與GC2為顯著相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.363;GC1與GC3相關(guān)不顯著，GC2與GC3相關(guān)也不顯著;GC含量與GC1和GC2極顯著相關(guān)，與GC3無(wú)顯著相關(guān);ENC與GC1不相關(guān)，與GC2顯著負(fù)相關(guān)，與GC3極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.521;GC1和GC兩個(gè)參數(shù)與CAI、 CBI和FOP極顯著相關(guān)， GC3與CAI、 CBI和FOP呈顯著相關(guān);Gravy與其余的密碼子參數(shù)均無(wú)顯著相關(guān);密碼子數(shù)目（N）與GC3極顯著相關(guān)外，不與ENC和CAI等其他參數(shù)顯著相關(guān)。

RSCU分析結(jié)果（表3）表明，RSCU大于1.00的密碼子數(shù)目為31個(gè)。其中：以U結(jié)尾的密碼子有16個(gè);以A結(jié)尾的密碼子有13個(gè);以G和C結(jié)尾的密碼子分別為1個(gè);以A或U結(jié)尾的密碼子占全部的93.54%。

2.2 中性繪圖分析

巨桉葉綠體基因中性繪圖表明，GC12的變化范圍為33.65%～55.45%，GC3的變化范圍為20.20%～37.00%，GC12與GC3未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明GC12與GC3相關(guān)性弱。突變對(duì)密碼子第1位、第2位和第3位堿基組成有著不同的影響。假如完全由隨機(jī)突變?cè)斐傻?，那么基因?yīng)該在對(duì)角線上。從圖1可以看出，絕大多數(shù)基因都分布于對(duì)角線上方，GC12均高于GC3，絕大多數(shù)基因所在的位點(diǎn)高于對(duì)角線，說(shuō)明選擇在密碼子偏好中起主要作用。

2.3 ENC-plot分析

ENC-plot繪圖以ENC為y軸，GC3S為x軸建立坐標(biāo)系，將所有參試基因定位于該坐標(biāo)系中，同時(shí)根據(jù)公式（1）添加標(biāo)準(zhǔn)曲線。ENC-plot分析結(jié)果（圖2）表明，盡管有一小部分偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是大多數(shù)基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近。為了更加準(zhǔn)確反映差異，先根據(jù)公式（1）求出ENC的理論值，再根據(jù)公式（2）求算出ENC比值。在此基礎(chǔ)上分析所有參試基因的ENC頻數(shù)分布（表4），統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，51.16%的基因分布在-0.05～0.05之間，34.88%的基因分布在0.05～0.15之間，9.30%的基因分布在-0.15～-0.05之間，另有2.33%的基因分布在-0.25～-0.15和0.15～0.25之間。這說(shuō)明突變對(duì)巨桉葉綠體基因組密碼子偏好的形成起重要作用。

2.4 對(duì)應(yīng)分析

對(duì)應(yīng)分析表明，第1軸貢獻(xiàn)率為17.68%，第2軸貢獻(xiàn)率為11.49%，第3軸、第4軸的貢獻(xiàn)率分別8.00%和5.76%。前4個(gè)向量的總貢獻(xiàn)率為42.93%。第1軸和第2軸的貢獻(xiàn)率均超過(guò)10%，說(shuō)明第1軸和第2軸都是密碼子偏好的主要影響因素。第1軸與GC、 CAI、 CBI和FOP呈極顯著的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.573、0.670、0.578和0.523;第1軸ENC呈極顯著的負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為-0.395; 第1軸與GC3S無(wú)顯著相關(guān)， 而與第3位同義密碼子A和G含量呈極顯著相關(guān)， 其相關(guān)系數(shù)分別為-0.440和-0.606。為了更加直觀地觀察密碼子偏好，建立以第1軸為x軸，以第2軸為y軸的平面坐標(biāo)系，將所有參試基因按不同功能分布于坐標(biāo)系中（圖3）。圖3結(jié)果顯示，核糖體蛋白基因分布相對(duì)集中，其余基因分布相對(duì)比較分散，說(shuō)明核糖體蛋白基因的密碼子偏好相近，與其他基因的密碼子偏好相差較大。

2.5 最優(yōu)密碼子的確定

以密碼子的ENC參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)參試基因進(jìn)行排序，從兩端各選取10%的基因（兩端各選取4個(gè)），分別建立高/低表達(dá)基因庫(kù)，在此基礎(chǔ)上重新計(jì)算各表達(dá)庫(kù)的RSCU，求算出兩個(gè)庫(kù)的ΔRSCU（表5）。以ΔRSCU>0.08為標(biāo)準(zhǔn)確定31個(gè)高表達(dá)密碼子（表5中*標(biāo)注的密碼子），其中12個(gè)以G結(jié)尾，8個(gè)以C結(jié)尾，6個(gè)以A結(jié)尾，5個(gè)以U結(jié)尾。

將表3中的高頻密碼子與表5中確定的高表達(dá)密碼子進(jìn)行分析，選取其中共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子。巨桉葉綠體基因中有12個(gè)最優(yōu)密碼子為UUG、CUU、GUU、UCC、UCA、ACA、UAU、UAA、CAU、AAU、AGA和GGA，其中10個(gè)密碼子以U或A結(jié)尾，另外2個(gè)以G或C結(jié)尾。

3 討論

遺傳密碼是指核苷酸序列與氨基酸序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系。20種蛋白質(zhì)氨基酸中Met和Trp兩種氨基酸只有一個(gè)密碼子，其余18種氨基酸均有2～6個(gè)不等密碼子編碼，即密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼同一氨基酸的密碼子為同義密碼子（朱圣庚和徐長(zhǎng)發(fā)， 2016）。同義密碼子差別主要在于第3位密碼子的變化。本研究中巨桉葉綠體基因組中GC3與GC1和GC2無(wú)顯著相關(guān)，并且明顯小于GC1和GC2。這說(shuō)明巨桉葉綠體基因密碼子偏好以A和U結(jié)尾，RSCU分析結(jié)果從定量分析的角度也充分證明這一觀點(diǎn)。這與已報(bào)道的黃芩（Scutellaria baicalensis）（王文斌等， 2018）、普通油茶（Camellia oleifera）（王鵬良等， 2018）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）（楊國(guó)鋒等， 2015）等植物葉綠體基因的特征一致。

生物在編碼氨基酸時(shí)經(jīng)常傾向使用某個(gè)特定的同義密碼子的現(xiàn)象稱為密碼子使用偏好性（吳憲明等， 2007）。巨桉葉綠體基因組的密碼子的ENC平均值為47.04。以35為標(biāo)準(zhǔn)，ENC低于35的為強(qiáng)偏好性密碼子;高于35的為弱偏好性密碼子（Jiang et al.， 2008）。因此，巨尾桉葉綠體基因組密碼子為弱偏好性的，CAI參數(shù)也支持這一觀點(diǎn)。

密碼子偏好受堿基組成、選擇、tRNA豐度、基因長(zhǎng)度和蛋白質(zhì)的疏水性等許多因素的影響 （梁菲菲， 2010）。本研究中由于密碼子數(shù)目不與ENC及CAI等密碼子參數(shù)顯著相關(guān)，所以巨桉葉綠體基因組中基因長(zhǎng)度對(duì)密碼子偏好沒(méi)有明顯作用;同樣，蛋白質(zhì)疏水性對(duì)巨桉葉綠體基因組密碼子偏好也無(wú)明顯作用;同義密碼子第3位A、G含量和GC含量與第1軸達(dá)到極顯著相關(guān)，表明堿基差異對(duì)密碼子的偏好有影響。CAI、CBI和FOP與第1軸極顯著相關(guān)，表明基因有選擇地使用高豐度的tRNA對(duì)應(yīng)的密碼子，導(dǎo)致基因的高表達(dá)（Ikemura，1981a，1981b，1985），說(shuō)明選擇是影響密碼子偏好的重要原因。由于第3位A、G含量和GC含量與第1軸的相關(guān)系數(shù)與CAI、CBI和FOP和第1軸的相關(guān)系數(shù)比較接近，因此突變和自然選擇在密碼子偏好中的作用基本相當(dāng)。中性繪圖分析表明，選擇是導(dǎo)致密碼子偏好的相對(duì)主要因素，而ENC-plot分析結(jié)果卻顯示突變占有較大比例。因此，本研究認(rèn)為突變和選擇在巨桉葉綠體基因組中可能起相對(duì)均衡的作用。

本研究以高表達(dá)的高頻密碼子為最優(yōu)密碼子，在巨桉葉綠體基因組中確定的12個(gè)最優(yōu)密碼子分別為UUG、CUU、GUU、UCC、UCA、ACA、UAU、UAA、CAU、AAU、AGA和GGA。巨桉葉綠體基因組最優(yōu)密碼子的確定為優(yōu)化目標(biāo)基因的密碼子，提高表達(dá)效率，從而利用葉綠體基因工程改良巨桉重要性狀奠定良好基礎(chǔ)。

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