胡昌亮 尹志剛 俸婷婷 周英

摘 要：構(gòu)建具有EGFP標(biāo)簽的抑癌基因p53表達(dá)載體，并驗(yàn)證其對(duì)肺癌細(xì)胞A549的影響。以質(zhì)粒pcDNA3.1-p53為模板，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因p53，將獲得的目的基因克隆至載體pcDNA3.1-EGFP上，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，雙酶切以及測(cè)序驗(yàn)證。將克隆好的載體，利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)用MTT法測(cè)不同時(shí)間段細(xì)胞OD值。結(jié)果表明，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，目的基因擴(kuò)增成功。雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果均證實(shí)，成功構(gòu)建了載體pcDNA3.1-EGFP-p53。轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。MTT法測(cè)定結(jié)果表明，目的基因轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞組所測(cè)得的OD值明顯低于對(duì)照組（p<0.01）。因此，具有EGFP標(biāo)簽的抑癌基因p53表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP-p53構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，對(duì)A549細(xì)胞具有一定抑制作用。為后續(xù)繼續(xù)研究p53-MDM2 生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：EGFP;抑癌基因;p53;表達(dá)載體;A549細(xì)胞

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）01-0001-05 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.001

腫瘤被作為多基因疾病，如果控制細(xì)胞分化的基因發(fā)生缺陷或變異，就會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的失控，加上一連串的變異，包括失去修補(bǔ)基因錯(cuò)誤的功能以及逃離監(jiān)控錯(cuò)誤的機(jī)制，形成失去秩序的組織等[1]，這些基因可為腫瘤基因，也可為腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)，與人類腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制基因是p53基因，超過50%的癌癥發(fā)生與其相關(guān)[2]，因其編碼一種分子質(zhì)量大約為53KDa的蛋白質(zhì)而得名，在DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖以及許多代謝過程中有重要作用，能夠有效地對(duì)抗組織增生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有維持基因組穩(wěn)定、抑制或阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生[3]。

p53位于人體17號(hào)染色體上，包含了11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，序列長(zhǎng)度大約為20 kb[4]，它編碼的p53蛋白含有393個(gè)氨基酸殘基，即被1182 bp基因序列編碼合成。張兆新等[5]利用EGFP熒光報(bào)告表達(dá)載體構(gòu)建了BRET模型，從而篩選出抑制p53-MDM2結(jié)合的小分子化合物，為治療腫瘤尋找了可能。本文通過將p53抑癌基因克隆至含EGFP的熒光報(bào)告基因表達(dá)載體上，并將其轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞A549中，觀察其是否熒光表達(dá)及其對(duì)A549細(xì)胞的影響，為后續(xù)研究p53-MDM2互作BRET（生物素發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移）模型，篩選出具有抗腫瘤作用的小分子抑制劑奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞

pcDNA3.1-p53、pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒以及大腸桿菌Dh5α 均由本實(shí)驗(yàn)保存。肺癌細(xì)胞 A549購(gòu)于中國(guó)昆明細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液以及1%谷氨酰胺的RPIM1640 培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購(gòu)自Takara公司;DNA膠回收試劑盒購(gòu)自四川成都福際生物有限公司;質(zhì)粒小提取試劑盒購(gòu)于天根生物;去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA;LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑、Taq DNA聚合酶、dNTP購(gòu)自Takara公司;RIPM1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibico公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀、穩(wěn)壓電泳儀及電泳槽（美國(guó) Bio-Rad公司）;超低溫高速離心機(jī)（Eppendoff 公司）;CO2 培養(yǎng)箱（3111，Thermo Fisher Scientific）;倒置熒光顯微鏡（徠卡）;微波爐（美的）;多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific Oy）;超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）等。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中p53基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，5’端分別添加Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，由上海英駿公司合成。

上游引物：5’-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT

下游引物：5’-CGCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG 。

1.5 pcDNA3.1-EGFP-p53表達(dá)載體構(gòu)建

獲取目的基因：利用質(zhì)粒小提取試劑盒對(duì)含pcDNA3.1-p53菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，以此質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增模板。擴(kuò)增體系為：模板DNA（10 pg-30 ng）10 μM，上下游引物各2 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL;反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性15 s，63℃退火15 s，72℃延伸60 s，34次循環(huán);72℃徹底延伸5 min，終止反應(yīng)。

基因克?。耗z回收純化PCR產(chǎn)物，用Takara快切酶進(jìn)行雙酶切，再次膠回，得到最終連接所需目的基因產(chǎn)物，并將其克隆到載體pcDNA3.1-EGFP上。按照以下體系進(jìn)行連接反應(yīng)：10×ligation buffer 2 μL，載體DNA 50 ng，目的基因p53（與載體DNA的摩爾比約為3），T4 DNA Ligase（350U/μL）1 μL，滅菌水補(bǔ)至20 μL，4℃過夜反應(yīng)，取部分連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后菌落PCR和提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，得到陽性克隆菌液送至上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 利用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-EGFP-p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞

采用LipofectamineTM 3000法轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞A549，該方法避免了后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)需要更換無血清培養(yǎng)基。按試劑盒操作說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前用胰酶消化細(xì)胞，用適量完全培養(yǎng)基按2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度平鋪于6孔板，置于含有5%CO237℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞至70%～90%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染。將6孔板分為三組，分別是空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-EGFP）、實(shí)驗(yàn)組（含目的基因pcDNA3.1-EGFP-p53質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染完成后24 h開始在熒光顯微鏡下觀察各組熒光情況[6]。

1.7 MTT法檢測(cè)pcDNA3.1-EGFP-p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h后的影響

（1）復(fù)蘇培養(yǎng)A549細(xì)胞，保持細(xì)胞狀態(tài)良好;（2）接種細(xì)胞5×104個(gè)/孔密度于24孔板中，每孔加入400 μL（設(shè)3個(gè)復(fù)孔），按上面的方法分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，至70%～90%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染;（3）參照LipofectamineTM 3000操作說明和要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn);（4）分別在轉(zhuǎn)染12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h后，每孔加入50 μLMTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，在顯微鏡下觀察到結(jié)晶體，棄掉上清液，加入400 μL DMSO溶液;（5）37℃搖床上緩慢搖10 min，待晶體溶解;（6）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每孔分三個(gè)，分裝到96孔板的小孔里，使用酶標(biāo)儀，在490 nm 處檢測(cè)吸光度[6]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：P <0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 p53基因的PCR擴(kuò)增與鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，挑取的3個(gè)單菌落做菌落PCR均在約1200 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小（1182 bp）大小一致，初步說明目的基因已連接到目的載體上且轉(zhuǎn)化成功。

2.2 重組載體pcDNA3.1-EGFP-p53的雙酶切鑒定

經(jīng)過雙酶切表明，出現(xiàn)1182 bp和超過2000 bp（載體大小為6119 bp）兩條條帶，與預(yù)期目的片段大小一致，進(jìn)一步表明此重組載體構(gòu)建成功，將陽性質(zhì)粒送公司測(cè)序后經(jīng)NCBI BLAST后，結(jié)果為目的片段。

2.3 質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP和質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-p53轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后熒光顯微鏡下不同時(shí)間段觀察結(jié)果

轉(zhuǎn)染后，能清晰的觀察到對(duì)照組有明顯的綠色熒光產(chǎn)生，說明空載體轉(zhuǎn)染成功。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組綠色熒光相對(duì)較弱，通過觀察熒光，檢測(cè)p53基因是否成功轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，還能觀察到不同時(shí)間段p53對(duì)A549細(xì)胞增殖的作用。在24 h開始出現(xiàn)微弱綠色熒光，可能由于轉(zhuǎn)染時(shí)間較短造成。在36 h開始熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，其中48 h時(shí)達(dá)到了最強(qiáng)，后又逐漸變?nèi)?，由此可以說明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

2.4 MTT法測(cè)pcDNA3.1-EGFP-p53轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后不同時(shí)間段OD值變化

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-p53質(zhì)粒的細(xì)胞株和對(duì)照組的OD值變化表明：獲得性表達(dá)外源p53基因的A549細(xì)胞，從24 h開始，其生長(zhǎng)速度明顯低于轉(zhuǎn)染含EGFP空載體對(duì)照組（P <0.01），其生長(zhǎng)明顯受到抑制。轉(zhuǎn)染的空載體和含p53基因目的質(zhì)粒從24 h開始檢測(cè)起，均與空白細(xì)胞組呈顯著性差異（P <0.01）。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以肺癌細(xì)胞A549作為研究對(duì)象，成功構(gòu)建具有EGFP標(biāo)簽的抑癌基因p53表達(dá)載體，通過熒光顯微鏡觀察到，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-EGFP-p53的A549細(xì)胞中均可觀察到綠色熒光。但由于構(gòu)建的目的載體中抑癌基因p53位于EGFP上游，所以pcDNA3.1-EGFP-p53的熒光比pcDNA3.1-EGFP的熒光弱。通過MTT法測(cè)得不同時(shí)間段p53對(duì)肺癌細(xì)胞A549的影響（P <0.01），與對(duì)照組相比，初步說明p53對(duì)A549具有一定抑制作用。為后續(xù)深入研究尋找激活p53小分子化合物構(gòu)建p53-MDM2互作BRET模型奠定了基礎(chǔ)。

p53與EGFP融合表達(dá)，作為目前熒光報(bào)告基因研究的熱點(diǎn)[7]，可以通過熒光觀察判斷目的基因是否表達(dá)，無需損傷細(xì)胞即可研究細(xì)胞內(nèi)事件增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）作為應(yīng)用最多的發(fā)光蛋白，510 nm處左右自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物，適于基因轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)研究和高通量篩選，尤其適用于基因轉(zhuǎn)移的定性研究。綠色熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為藍(lán)光波長(zhǎng)，因此可用藍(lán)光波長(zhǎng)激發(fā)綠色熒光，觀察其表達(dá)情況。

癌癥是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類生活水平和人類健康的主要原因之一，也是困擾了人們多年的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)難題[8]。研究發(fā)現(xiàn)，p53作為控制保護(hù)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)移主要通路的腫瘤抑制因子，具有抑制或阻止細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化、維持基因組穩(wěn)定的功能;mdm2 是 p53 的主要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)產(chǎn)物 MDM2 蛋白可與 p53蛋白結(jié)合而抑制 p53 的正常生物學(xué)功能，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前以研究p53-MDM2作為癌癥治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，胡純琦[1]、李翔[9]等課題組利用此靶點(diǎn)進(jìn)行了小分子抑制劑的篩選，其主要使用的是熒光偏振作用篩選。本課題為了更好尋找抑制p53-MDM2結(jié)合的小分子試劑，提出了構(gòu)建p53-MDM2互作的BRET模型[10-14]，其中p53-EGFP融合表達(dá)是關(guān)鍵一步，為后續(xù)高效篩選小分子化合物提供了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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