王坤英 姜于蘭

摘 要：采集貴州貴陽花溪濕地公園山林土壤，分離得到Paraboeremia屬真菌一新記錄種，對(duì)該種結(jié)合形態(tài)特征及分子系統(tǒng)學(xué)分析基于ITS，LSU，rpb2和tub四個(gè)基因片段，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，該標(biāo)本HGUP1801與采自荷蘭卷柏葉片上的Paraboeremia selaginellae聚集在一起，并且形成很高的支持率，將該種定名為Paraboeremia selaginellae。研究標(biāo)本保存在貴州大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室（HGUP）。

關(guān)鍵詞：亞隔孢殼科;形態(tài)學(xué);分子系統(tǒng)學(xué);分類

中圖分類號(hào)：S432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）01-0006-04 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.002

Paraboeremia Q.Chen & L.Cai屬于Ascomycota子囊菌門，座囊菌綱Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleosporales，亞隔孢殼科Didymellaceae。截止目前，該屬已報(bào)道6種，包括3個(gè)新組合種，新組合種是由莖點(diǎn)霉屬Phoma Fr.和莖點(diǎn)霉屬的有性屬亞隔孢殼屬Didymella Sacc.移入該屬[1]。Chen等[1]以Paraboeremia selaginellae為模式種建立該屬，其中包括Paraboeremia adianticola和Paraboeremia putaminum兩個(gè)結(jié)合新種。 Jiang等[2]報(bào)道了Paraboeremia屬的三個(gè)新種，Paraboeremia camelliae、P.litseae和P.oligotrophica。

莖點(diǎn)霉屬由Fries（1821）建立，該屬真菌是一類重要的植物病原菌，分布廣泛且具有豐富的多樣性，主要引起植物葉片及莖桿上的病斑，可導(dǎo)致作物產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失，其中一些物種還被列為檢疫性真菌，對(duì)該屬真菌進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定非常重要[3]。但傳統(tǒng)上區(qū)分該屬的形態(tài)特征相當(dāng)有限，主要包括分生孢子器、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的形狀和大小，而這些相對(duì)簡(jiǎn)單的無性形態(tài)特征不足以對(duì)相似的不同物種進(jìn)行辨別。至2004年，在MycoBank中已記錄有3000多個(gè)莖點(diǎn)霉屬的物種名稱。究其原因，除了形態(tài)特征在物種區(qū)分的局限性外，使用傳統(tǒng)的寄主相關(guān)命名法也是產(chǎn)生如此大量名稱的重要原因。

近些年來，分子系統(tǒng)學(xué)技術(shù)融入莖點(diǎn)霉屬Phoma、種以及近似屬、種的分類鑒定中[1，3-5]。De Gruyter等[6]根據(jù)對(duì)莖點(diǎn)霉屬和相關(guān)無性屬分子系統(tǒng)學(xué)的研究結(jié)果，對(duì)莖點(diǎn)霉屬?gòu)?fù)合群進(jìn)行了重新劃分，根據(jù)模式屬Didymella建立亞隔孢殼科Didymellaceae，包括了廣義莖點(diǎn)霉和其他相關(guān)屬。Aveskamp等[3]研究同樣發(fā)現(xiàn)，莖點(diǎn)霉屬是一個(gè)多系類群，傳統(tǒng)分類上歸于該屬的物種在系統(tǒng)發(fā)育研究中分散在至少6個(gè)科中，他們通過進(jìn)一步研究建議，以莖點(diǎn)霉屬模式種草莖點(diǎn)霉Phoma herbarum Westend.所在的單系分支作為狹義莖點(diǎn)霉屬，歸屬于亞隔孢殼科，包含莖點(diǎn)霉屬、殼二孢屬Ascochyta Libert、亞隔孢殼屬 Didymella等重要病原真菌類群。De Gruyter等和Aveskamp等[7-8]通過系統(tǒng)學(xué)分析對(duì)莖點(diǎn)霉屬內(nèi)物種的分類地位做了部分修訂，在澄清亞隔孢殼科內(nèi)屬間關(guān)系上已有重要進(jìn)展，但仍有較多物種的分類情況尚未解決。Chen等根據(jù)形態(tài)特征的觀察以及基于LSU，ITS，tub2和rpb2四個(gè)序列位點(diǎn)的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將亞隔孢殼科劃分為17個(gè)有較高支持率的單系屬，包括Paraboeremia等9個(gè)新屬。Paraboeremia屬真菌分布廣泛，可生存于腐生的葉片、土壤、巖石塊、發(fā)病葉片、果樹的根際周圍等[2，9]。該屬的形態(tài)特征是產(chǎn)孢細(xì)胞球形或翁形，分生孢子無隔，具油滴，橢球形，直或彎曲，無色透明至淺綠。作者在土壤真菌調(diào)查中，分離獲得一株疑似莖點(diǎn)霉屬真菌，依據(jù)其他研究者對(duì)于該屬及相似屬研究中采用的基因條形碼[10]，選擇ITS、LSU、tub、rpb2四個(gè)基因片段，利用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)分類方法對(duì)該菌株進(jìn)行系統(tǒng)分類研究。

1 材料與方法

1.1 土壤采集

實(shí)驗(yàn)材料采自貴陽花溪濕地公園山林土，未被破壞松樹林土壤將采集的研究標(biāo)本置于塑料袋或牛皮紙袋，貼標(biāo)簽（注明采集地、采集時(shí)間、植被、土壤類型、海拔、經(jīng)緯度等信息）后密封。

1.2 土壤真菌的分離純化、保存

每份土樣稱取10 g，稀釋100倍后涂抹于孟加拉紅培養(yǎng)基上，每份土樣3個(gè)重復(fù)分別于常溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～7 d后，挑取單菌落于含有青霉素的PDA平板上，獲得純菌種，無菌操作。無菌水冷存管保存：將經(jīng)適宜培養(yǎng)的菌種塊（3～4塊）置于盛有滅菌水的冷存管中，密封后置于4℃～10℃的冰箱中，每一菌種4個(gè)備份，無菌操作。分離菌株保存在貴州大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室（HGUP），菌株號(hào)為HGUP1801。

1.3 形態(tài)鑒定

將保存的菌株活化，接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基上（OA），待菌株產(chǎn)孢。然后使用OLYMPUSBH體視鏡制片，使用OLYMPUSBH照相顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.4 DNA提取和PCR反應(yīng)

菌株總DNA提取自純培養(yǎng)物：用滅菌的手術(shù)刀刮取2～3 w的純培養(yǎng)物菌絲體50 mg，按真菌DNA試劑盒Fungal gDNA Kit GD2416（Biomiga 公司生產(chǎn)）說明書提取，獲得的DNA溶液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。選擇引物ITS4/ITS5[11]，LROR/LR5[12]，RPB2-5F/RPB2-7cR[13]和TUB2Fd/TUB4Rd[6]。本研究使用25 μL PCR反應(yīng)體系，包括：正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，2xPCR Master Mix 12.5 μL。將該種所獲得的DNA序列上傳至GenBank（表1）。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將用于建樹的Fasta文件（14個(gè)序列），經(jīng)Bioedit進(jìn)行序列比對(duì)及手工校正后，保存為Fasta格式。將Fasta格式文件在網(wǎng)絡(luò)軟件ALTER（Alignment Transformation EnviRonment，http：//sing.ei.uvigo.es/ALTER/）中轉(zhuǎn)換為PHY格式;基于CIPRES SCIENCE GATEWAY （http：//www.phylo.org/）網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，使用RAxML-HPC BlackBox（8.2.10）軟件，構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Treeview軟件查看tree格式文件，在AI（Adobe Illustrator CS5）軟件編輯菌株號(hào)和自舉支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

以Vacuiphoma bulgarica（CBS 357.84）為外群的加合基因樹中，Paraboeremia屬以100%的支持率分成兩支，分子系統(tǒng)學(xué)研究表明Paraboeremia selaginellae HGUP1801以94%的支持率與P.selaginellae CBS122.93聚集形成一支。

2.2 形態(tài)描述

在燕麥（OA）培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)較快，圓形，具大量透明、絮狀氣生菌絲，分生孢子器埋生或半埋生在靠近邊緣的同心環(huán)上，灰橄欖色，背面同色，27℃培養(yǎng)2 w，直徑達(dá)4 cm。分生孢子器黑棕色，單生，球形，近球形或翁形，埋生或半埋生，具有單個(gè)孔口，100～270 μm× 100～240 μm，分生孢子器壁擬薄壁組織狀，壁厚，由透明棕色細(xì)胞構(gòu)成，3～4層細(xì)胞，外1～2層呈棕色，厚度達(dá)13.4～16.3 μm。分生孢子單胞，圓柱形至橢圓形，平滑，綠色，偶爾輕微彎曲，2.5～4 × 1 ～2 μm，具1～2個(gè)油滴。

采自貴陽花溪濕地公園山林土，106°E，26°N，海拔1140 m。采集時(shí)間：2017年8月，采集人：王坤英，菌株號(hào)：HGUP1801。

3 結(jié)論與討論

目前全世界報(bào)道Paraboeremia屬6個(gè)種，由于原始標(biāo)本的丟失，在荷蘭卷柏（Selaginella sp.）葉片上分離得到新的模式標(biāo)本[14]。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，采自我國(guó)貴州貴陽花溪山林土的Paraboeremia與采自荷蘭卷柏葉片上的Paraboeremia selaginellae聚集在一起，且二者具有相同的形態(tài)特征，分生孢子大小相似（2.5～4 × 1～2 μm ?VS 2.5～5 × 1～2 μm），但采自荷蘭卷柏葉片上的Paraboeremia selaginellae具有較大的分生孢子器（130～360×120～320 μm ?VS 100～270×100～240 μm）。

本文菌株采自貴州貴陽花溪濕地公園山地土，花溪濕地公園是典型的城市濕地，具有河流、農(nóng)田和庫(kù)塘等多類型濕地，生物多樣，生態(tài)良好，屬于亞熱帶濕潤(rùn)氣候。土壤微生物生物量的多少是土壤活性大小的標(biāo)志[15]，研究土壤微生物具有重要的意義。

綜上所述，該研究中采自中國(guó)貴州的Paraboeremia的標(biāo)本在形態(tài)上和系統(tǒng)發(fā)育上均與Paraboeremia selaginellae相同，因此，鑒定該標(biāo)本的分類地位為Paraboeremia selaginellae （Sacc.）Q.Chen & L.Cai。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Chen Q，Jiang JR，Zhang GZ，et al.Resolving the Phoma enigma[J].Studies in Mycology，2015（82）：137-217.

[2] Jiang JR，Chen Q，Cai L.Polyphasic characterisation of three novel species of Paraboeremia[J].Mycological Progress，2016，16（4）：285-295.

[3] Aveslcamp MM，de Gruyter J，Woudenberg JHC，et al.Highlights of the Didymellaceae：A polyphasic approach to characterise Phoma and related pleosporalean genera[J].Studies in Mycology，2010，65（1）：1-60.

[4] Aveskamp MM，deGruyter J，Crous PW，Biology and recent developments in the systematics of Phoma.a complex genus of major quarantine significance[J].Fungal Diversity，2008（31）：1-18.

[5] de Gruyter J，Woudenberg JHC，Aveslcamp MM，et al.Molecular phylogeny of Phoma and allied anamorph genera：Towards a reclassification of the Phoma complex[J].Mycological Research，2009，113（4）：508-519.

[6] Aveskamp MM，Johannes DG，Monica AM，et al.DNA phylogeny reveals polyphyly of Phoma section Peyronellaea and multiple taxonomic novelties[J].Mycologia，2009，101（3）：363-382.

[7] De Gruyter J，Woudenberg JHC，Aveskamp MM，et al.Systematic reappraisal of species in Phoma section Paraphoma，Pyrenochaeta and Pleurophoma[J].Mycologia，2010，102（5）：1066-1081.

[8] De Gruyter J，Woudenberg JHC，Aveskamp MM，et al.Redisposition of phoma-like anamorphs in Pleosporales[J].Studies in Mycology，2012（75）：1-36.

[9] Chen Q，Hou LW，Duan WJ，et al.Didymellaceae revisited[J].Studies in Mycology，2017（87）：105-159.

[10] Valenzuela-Lopez N，Cano-Lira JF，Guarro J， et al.?Coelomycetous Dothideomycetes with emphasis on the families Cucurbitariaceae and Didymellaceae[J]. Studies in Mycology，2018（90）：1-69.

[11] White TJ，Bruns T，Lee S.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In：PCR Protocols：a guide to methods and applications[M].California：Academic Press，1990：315-322.

[12] Vilgalys R，Hester M，Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species[J].Journal of Bacteriology，1990，172（8）：4238-4246.

[13] Liu YJ，Whelen S，Hall BD，Phylogenetic relationships among ascomycetes evidence from an RNA polymerase II subunit[J].Molecular Biology and Evolution， 1999，16（12）：1799-1808.

[14] Boerema GH，de Gruyter J，Noordeloos ME，New names in Phoma[J].Persoonia，1995，16（1）：131-131.

[15] 蔡 瓊，丁貴杰，森林土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)研究概述[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2006，25（3）：256-261.