奉彬 謝芝勛 鄧顯文 張艷芳 謝麗基 謝志勤 范晴 曾婷婷 羅思思 黃嬌玲

摘要：【目的】建立能同時檢測雞新城疫病毒（NDV）、雞細(xì)小病毒（ChPV）和禽流感病毒（AIV）的三重PCR檢測方法，為臨床上快速診斷及有效防控NDV、ChPV和AIV的單一或混合感染提供技術(shù)支持。【方法】參考NCBI中已公布NDV的F基因（登錄號DQ195265.1）、ChPV的NS1基因（登錄號GU214704.1）和AIV的M基因保守區(qū)（登錄號DQ485211.1），設(shè)計合成針對NDV、ChPV和AIV的特異性引物，應(yīng)用這3對引物建立三重PCR檢測方法，對反應(yīng)體系及擴增程序進行優(yōu)化，并通過特異性試驗、敏感性試驗、重復(fù)性試驗和臨床樣品檢測等評估其實用性?！窘Y(jié)果】優(yōu)化后的三重PCR反應(yīng)體系為ChPV和AIV的上、下游引物各0.5 μL，NDV的上、下游引物各1.0 μL，NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0 μL，Premix TaqTM 12.5 μL，無RNase水補足至25.0 μL。最佳擴增程序：95.0 ℃預(yù)變性5 min;94.0 ℃ 1 min，58.5 ℃ 1 min，72.0 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72.0 ℃延伸10 min，12.0 ℃結(jié)束反應(yīng)。建立的三重PCR能同時擴增出NDV（453 bp）、ChPV（687 bp）和AIV（239 bp）的特異性條帶，對應(yīng)的最低檢測下限分別為2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV，但擴增傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、馬立克病毒（MDV）、傳染性喉氣管炎病毒（AILTV）和禽肺炎病毒（APV）等病原體均呈陰性。應(yīng)用建立的三重PCR對50份雞喉頭或泄殖腔棉拭子樣品進行檢測，結(jié)果顯示有1份NDV陽性、9份ChPV陽性和2份AIV陽性樣品，其中包含2份ChPV和AIV均呈陽性的樣品，1份ChPV和NDV均呈陽性的樣品，與常規(guī)PCR的檢測結(jié)果一致。【結(jié)論】建立的三重PCR能同時對NDV、ChPV和AIV 3種病原進行特異性診斷，在混合感染病例鑒別診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 雞新城疫病毒;雞細(xì)小病毒;禽流感病毒;三重PCR;特異性;敏感性

中圖分類號： S854.44? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）11-2576-07

Development of a triplex PCR assay for detection of Newcastle disease virus，chicken parvovirus and avian influenza virus

FENG Bin， XIE Zhi-xun*， DENG Xian-wen， ZHANG Yan-fang， XIE Li-ji，

XIE Zhi-qin， FAN Qing， ZENG Ting-ting， LUO Si-si， HUANG Jiao-ling

（Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】A triplex PCR assay for detecting Newcastle disease virus（NDV），chicken parvovirus（ChPV） and avian influenza virus（AIV） was developed to provide technical support for quick diagnosis and effective control of NDV，ChPV and AIV single or mixed infections. 【Method】According to the conserved regions of NDV F gene（GenBank： DQ195265.1）， ChPV NS1gene（GenBank： GU214704.1） and AIV M gene（GenBank： DQ485211.1） in NCBI， three sets of specific primers targeting NDV， ChPV and AIV were designed. The triplex PCR for simultaneous detection of NDV，ChPV and AIV was established by optimizing the reaction conditions. The specificity， sensitivity， repeatability and clinical sample detection of the triplex PCR were detected. 【Result】The optimized triplex PCR assays were conducted as follows： 25.0 μL reaction mixtures were prepared containing 0.5 μL of each upstream and downstream primers of ChPV and AIV， 1.0 μL of each upstream and downstream primers of NDV， 1.0 μL of DNA/cDNA template of ChPV， AIV and NDV， separately， 12.5 μL of Premix TaqTM DNA polymerase， and 5.5 μL of RNase-free water. The thermal cycling conditions for amplifying the triplex PCR of NDV，ChPV and AIV were as follows： one cycle of denaturation at 95.0 ℃ for 5 min followed by 35 cycles of amplification at 94.0 ℃ for 1 min， 58.5 ℃ for 1 min and 72.0 ℃ for 1 min， and thereafter an extension at 72.0 ℃ for 10 min， and ended at 12.0 ℃. The results indicated that the triplex PCR assay successfully amplified 453 bp specific bands for NDV， 687 bp for ChPV and 239 bp for AIV.? The lowest detection limit of the assay was 2.5 pg for NDV， 6.4 pg for ChPV and 2.0 pg for AIV.? No specific amplification product was observed using infectious bronchitis virus（IBV）， avian reovirus（ARV）， Marek's disease virus（MDV）， avian infectious laryngotracheitis virus（AILTV） and avian pneumonia virus（APV）. To evaluate the triplex PCR， 50 cotton swabs for throat and cloa-ca clinical samples were detected. The clinical results detected by the triplex PCR was accordant with the results detected by single PCR for the NDV， ChPV and AIV separately， there were one positive NDV sample， nine ChPV positive samples and two AIV positive samples， which contained two samples positive for ChPV and AIV， one sample positive for ChPV and NDV. 【Conclusion】The triplex PCR assay can specifically diagnose NDV， ChPV and AIV at the same time， and has great potential in identification of mixed infection cases.

Key words： Newcastle disease virus; chicken parvovirus; avian influenza virus; triplex PCR; specificity; sensibility

0 引言

【研究意義】禽流感（Avian influenza，AI）又稱為歐洲雞瘟，是由A型流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類傳染病綜合征，其病程初始表現(xiàn)為突然發(fā)病且無明顯臨床癥狀，病程稍長則表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)、消化、呼吸和生殖等綜合病征，伴隨采食量減少、產(chǎn)蛋率下降，且易并發(fā)感染其他疾病，給養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失（甘孟侯，2002）。AIV基因組由8個獨立節(jié)段構(gòu)成的單股負(fù)鏈RNA組成，分別編碼HA、NA、M、PB1、PB2、NP、PA和NS蛋白（吳青等，2017;鄭麗榮等，2019）。新城疫（Newcastle disease，ND）俗稱亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種禽類急性烈性傳染病，具有高度接觸性和敗血性等特征（李建偉和劉強，2013）。雞群感染NDV常出現(xiàn)高熱、黏膜出血、呼吸困難及下痢等癥狀，發(fā)病急，病情重，且引起較高的死亡率（丁壯等，2015）。NDV基因組由一條不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA組成，其基因組編碼NP、P、M、F、HN和L蛋白（蘇文政，2011）。目前，ND和AI已被列入一類動物疫病（殷震和劉景華，1997;張毅等，2014;劉華雷和王志亮，2015）。雞細(xì)小病毒（Chicken parvovirus，ChPV）是引起雞腸道疾病的主要病原體之一，可導(dǎo)致雞群出現(xiàn)急性或慢性腸道性疾病如矮小綜合癥和營養(yǎng)不良綜合癥，其臨床表現(xiàn)為腹瀉、精神沉郁、體溫失調(diào)、生長遲緩和飼料消耗增加等（Guy，1998），在北美、波蘭、巴西、匈牙利、克羅地亞和韓國等地均有報道，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)雞業(yè)造成重大損失（Bi?in et al.，2011;Palade et al.，2011;Domanska-Blicharz et al.，2012;Koo et al.，2015;Nu?ez et al.，2015）。ChPV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，其基因組為單鏈線狀DNA，大小約5.0 kb，基因組編碼NS、NP和VP蛋白（Zsak et al.，2008，2015）。目前，因NDV、ChPV和AIV引起的疾病給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來極大經(jīng)濟損失，因此，亟待建立一種能同步檢測NDV、ChPV和AIV的診斷方法，為臨床病原監(jiān)測及防控提供技術(shù)支持?！厩叭搜芯窟M展】在我國，已有學(xué)者將AIV、NDV、ChPV、禽肺炎病毒（Avian pneumovirus，APV）、雞傳染性支氣管病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）和禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）間進行兩兩組合，建立了多種二重PCR檢測方法。袁萬哲等（2015）基于NDV的M基因和AIV的M1基因保守序列，成功建立了能同時檢測NDV和AIV的二重RT-PCR檢測方法;奉彬等（2016）將檢測ChPV與ARV的特異性引物進行組合，經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)條件后建立了同時檢測ChPV和ARV的二重PCR檢測方法;劉金玲等（2016）建立了針對NDV和IBV的二重RT-PCR檢測方法，且證實該方法具有很好的特異性;謝志勤等（2016）建立的H9亞型AIV和APV二重RT-PCR檢測方法具有特異、敏感及快速的特點，可用于同時檢測H9亞型AIV和APV;何瑩等（2017）建立的ChPV和AIV二重PCR檢測方法具有特異性好及靈敏度高的特點，對ChPV和AIV的檢測下限均為100 fg;王珂等（2017）針對NDV強、弱毒株建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR可快速區(qū)分疫苗接種動物和野毒感染動物;張曼和韓飛（2018）基于NDV的F基因、安卡拉病毒（FAV-4）的hexon基因和AIV的M基因保守序列，建立了能同時檢測NDV、FAV-4和AIV的三重RT-PCR?！颈狙芯壳腥朦c】二重及二重以上的多重PCR主要用于鑒定某些病原微生物或同時檢測多種病原體，在臨床應(yīng)用中具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟簡便性等特點，但目前未見針對NDV、ChPV和AIV三重PCR檢測方法的建立。【擬解決的關(guān)鍵問題】參考NCBI中已公布NDV的F基因、ChPV的NS1基因和AIV的M基因保守片段，設(shè)計并合成能同時檢測NDV、ChPV和AIV的特異性引物，建立同時檢測3種病毒的三重PCR檢測方法并驗證其特異性、敏感性及實用性，為臨床上快速診斷及有效防控NDV、ChPV和AIV的單一或混合感染提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

AIV（H1N1、H3N2、H4N6、H6N6、H9N2和H11N9株）、ChPV、NDV（F48E9和LaSota株）、IBV（Mass 41株）、ARV（S1133株）、傳染性喉氣管炎病毒（Avian infectious laryngotracheitis virus，AILTV）北京（Beijing）株、APV（MN-10株）和禽大腸桿菌（Escherichia coli O2）均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存提供。H16N3、H15N9、H14N5、H9N6、H7N2和H5N2亞型AIV滅活抗原由美國康涅狄格州大學(xué)禽病診斷研究室惠贈;H13N6、H12N5、H10N3、H8N4和H2N3亞型AIV由香港大學(xué)惠贈;馬立克氏病活疫苗CVI988株（MDV CVI988）購自南京梅里亞動物保健品公司;EasyPure Viral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司;100 bp DNA Ladder（Dye Plus）Marker、Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體、MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit和Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 Plus Dye）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1. 2 引物設(shè)計與合成

參考NCBI GenBank中已公布NDV的F基因（登錄號DQ195265.1）、ChPV的NS1基因（登錄號GU 214704.1）及AIV的M基因保守區(qū)（登錄號DQ485211.1），運用Primer Premier 5.0、DNASTAR引物設(shè)計軟件和BLAST在線工具對引物進行比對篩選，委托深圳華大基因科技有限公司合成針對NDV、ChPV和AIV三重PCR檢測方法的特異性引物（表1）。

1. 3 病毒核酸提取

根據(jù)EasyPure Viral DNA/RNA說明分別從ChPV、AIV、MDV、AILTV、ARV、APV、NDV和IBV提取DNA/RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將AIV、NDV、ARV、IBV和APV的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;同時參照MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit說明提取E. coli的DNA，將上述抽提產(chǎn)物均置于-30 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 三重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

建立的三重PCR反應(yīng)體系25.0 μL：NDV、ChPV和AIV的上、下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，Premix TaqTM 12.5 μL，NDV、ChPV和AIV的DNA/cDNA模板各1.0 μL（混合模板3.0 μL），以無RNase水補足至25.0 μL。分別優(yōu)化三重PCR的退火溫度（50.0～64.0 ℃）和各引物濃度。三重PCR擴增程序：95.0 ℃預(yù)變性5 min;94.0 ℃ 1 min，退火溫度退火1 min，72.0 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72.0 ℃延伸10 min，12.0 ℃結(jié)束反應(yīng)。取6.0～8.0 μL的PCR擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1. 5 三重PCR特異性試驗

采用建立的三重PCR擴增預(yù)先提取的NDV、ChPV、AIV、IBV、MDV、ARV、APV、AILTV和E. coli核酸樣品，檢驗其特異性。

1. 6 三重PCR敏感性試驗

測定NDV、ChPV和AIV的原始核酸濃度，分別對3種原始核酸模板進行10倍梯度稀釋，并設(shè)陰性對照（以無RNase水代替核酸模板）和空白對照（不加任何模板），評估三重PCR的敏感性。

1. 7 三重PCR重復(fù)性試驗

以建立的三重PCR檢測方法對NDV、ChPV和AIV的混合模板進行檢測，重復(fù)5次，驗證其可靠性。

1. 8 三重PCR臨床樣品檢測

應(yīng)用建立的三重PCR對來自廣西不同規(guī)模化雞場的50份喉頭或泄殖腔棉拭子樣品進行檢測，再用常規(guī)PCR按上述三重PCR的最佳條件對這50份喉頭或泄殖腔棉拭子樣品進行檢測，驗證二者是否具有一致性。

1. 9 序列分析

對NDV、ChPV和AIV陽性PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收及純化后，分別與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定呈陽性的3種克隆質(zhì)粒送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序。最后采用ClustalX 1.81整理分析測序結(jié)果，并運用MEGA 7.02構(gòu)建ChPV的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 三重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

優(yōu)化后的最佳三重PCR反應(yīng)體系25.0 μL：ChPV和AIV的上、下游引物各0.5 μL，NDV的上、下游引物各1.0 μL（圖1），NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0 μL，Premix TaqTM 12.5 μL，無RNase水補足至25.0 μL。最佳擴增程序：95.0 ℃預(yù)變性5 min;94.0 ℃ 1 min，58.5 ℃ 1 min，72.0 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72.0 ℃延伸10 min，12.0 ℃結(jié)束反應(yīng)（圖2）。

2. 2 三重PCR特異性試驗結(jié)果

采用建立的三重PCR檢測方法對ChPV、NDV和AIV的單一或混合模板進行檢測，結(jié)果均成功擴增出NDV（453 bp）、ChPV（687 bp）和AIV（239 bp）的特異性條帶（圖3）;而其他對照病原體均呈陰性，表明建立的三重PCR檢測方法特異性良好。

2. 3 三重PCR敏感性試驗結(jié)果

測得NDV原始核酸濃度為25.3 ng/μL，ChPV原始核酸濃度為63.6 ng/μL，AIV原始核酸濃度為20.1 ng/μL。三重PCR檢測方法的最低檢測下限分別為2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV（圖4），表明建立的三重PCR敏感性較高。

2. 4 三重PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

以建立的三重PCR檢測方法對NDV、ChPV和AIV的混合模板進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5次重復(fù)均能擴增出NDV（453 bp）、ChPV（687 bp）和AIV（239 bp）的特異性條帶（圖5），且條帶均勻一致，表明建立的三重PCR重復(fù)性好。

2. 5 三重PCR的臨床檢測效果

應(yīng)用建立的三重PCR檢測方法對來自廣西區(qū)內(nèi)不同規(guī)?；u場的50份喉頭或泄殖腔棉拭子樣品進行檢測，結(jié)果顯示有1份NDV陽性、9份ChPV陽性和2份AIV陽性樣品，其中包含2份ChPV和AIV均呈陽性的樣品，1份ChPV和NDV均呈陽性的樣品，與常規(guī)PCR的檢測結(jié)果一致。圖6為NDV、ChPV和AIV三重PCR檢測方法對部分樣品的臨床檢測結(jié)果。

2. 6 三重PCR擴增目的片段的測序結(jié)果

三重PCR擴增獲得的目的片段經(jīng)BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)測序獲得的687 bp ChPV目的序列與Chic-ken parvovirus isolate ADL120686（登錄號KJ486491）的同源性高達96%，453 bp NDV目的序列與Newcastle disease virus isolate HN1007（登錄號KX761866.1）的同源性高達99%，239 bp AIV目的序列與Influenza A virus[A chicken/Guangxi/C227/2015（H9N2）]（登錄號KX130848.1）的同源性高達99%。將測序獲得的一條ChPV核苷酸序列（687 bp）與GenBank中已發(fā)布不同國家的ChPV/TuPV全基因序列進行比對分析，并采用ClustalX 1.81和MEGA 7.02構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進化樹，結(jié)果表明，17個ChPV/TuPV株分布在基于NS1基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹的不同基因亞型分支上，本研究測序獲得的ChPV序列與來自韓國的Chicken parvovirus isolate ADL120686株處于同一進化分支（圖7），親緣關(guān)系最近。

3 討論

隨著我國家禽業(yè)的規(guī)模集約化發(fā)展，雞群混合感染和二次感染現(xiàn)象日益增多。目前，ND和AI是影響家禽業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的主要疾病，也是我國大型養(yǎng)雞場常見多發(fā)的疾病，已引起人們的高度重視;ChPV是養(yǎng)禽業(yè)中一種新發(fā)現(xiàn)的傳染病毒，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。鑒于NDV、ChPV和AIV對我國家禽業(yè)的危害，因此亟待建立一種特異、敏感的快速鑒別診斷方法，以便于采取有效而全面的防控措施，降低禽類傳染性疾病的發(fā)生，進而提高我國的養(yǎng)禽業(yè)水平。當(dāng)前，傳統(tǒng)的病毒鑒定方法有病毒分離、瓊脂擴散試驗和ELISA等，但這些方法存在耗時長及靈敏度低等弊端。相比之下，PCR具有操作時間短、特異性高和靈敏度高等優(yōu)點（肖躍強等，2018）。在臨床樣品中常出現(xiàn)多種病原體混合感染的病例，通過常規(guī)PCR難以實現(xiàn)快速檢測和鑒別診斷。為此，本研究針對AIV、NDV和ChPV 3種病毒建立三重PCR檢測方法，旨在實現(xiàn)快速鑒別診斷。與常規(guī)的PCR檢測方法相比，多重PCR使用多對不同引物同時擴增多種不同的核酸模板，有效彌補了常規(guī)PCR的不足，同時節(jié)省人力物力，提高檢測效率，且極大縮短檢測時間。但在同一多重PCR反應(yīng)體系中，不同引物間、不同模板間及引物與模板間均可能產(chǎn)生競爭性抑制反應(yīng)，從而影響擴增效率。因此，需在雙重或多重PCR的建立過程中盡量對各類條件進行優(yōu)化，以避免因引物與模板間的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生非特性擴增。此外，每個引物的退火溫度應(yīng)盡可能一致，以確保擴增產(chǎn)物量的相對平衡（Xie et al.，2014;劉婷婷等，2015）。

本研究通過設(shè)計合成NDV、ChPV和AIV的特異性引物，成功擴增出NDV（453 bp）、ChPV（687 bp）和AIV（239 bp）的特異性目的片段，表明每對引物都具有很強的擴增效率和特異性。建立的三重PCR檢測方法可同時檢測樣品中的NDV、ChPV和AIV核酸，對掌握雞群感染NDV、ChPV和AIV后的排毒狀況十分重要，也有利于臨床上NDV、ChPV和AIV的流行病學(xué)調(diào)查。在檢驗三重PCR的敏感性時，將三重PCR與常規(guī)PCR的最低檢測下限進行對比，發(fā)現(xiàn)前者與后者相比相應(yīng)降低1×102～1×103個數(shù)量級，但仍然高度敏感（NDV、ChPV、AIV核酸的最低檢測下限分別為2.5、6.4和2.0 pg），能滿足臨床上的動物疫病檢測要求。應(yīng)用建立的三重PCR檢測方法對臨床樣品進行檢測，并與常規(guī)PCR進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三重PCR檢測方法的檢測結(jié)果與常規(guī)PCR檢測結(jié)果一致，有1份NDV陽性、9份ChPV陽性和2份AIV陽性樣品，其中包含2份ChPV和AIV均呈陽性的樣品，1份ChPV和NDV均呈陽性的樣品，表明建立的三重PCR檢測方法在混合感染病例鑒別診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景，同時說明廣西雞群已存在NDV、ChPV與AIV混合感染的現(xiàn)象，各養(yǎng)雞場應(yīng)給予重視并加強防控。

4 結(jié)論

建立的三重PCR檢測方法能同時對NDV、ChPV和AIV 3種病原進行特異性診斷，在混合感染病例鑒別診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）