董亞萍 馮東岳 孫晶 張小明 胡鯤

摘要：【目的】明確連翹有效成分延緩嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）對恩諾沙星的耐藥性及其對藥物主動外排作用中耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族（RND）相關(guān)基因表達(dá)的影響，為明確連翹延緩氟喹諾酮類藥物耐藥性的有效成分及揭示其延緩機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā坑^測連翹提取液及其與恩諾沙星聯(lián)合作用對嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長的影響，測定連翹有效成分（連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯苷B）作用于嗜水氣單胞菌前后的最小抑菌濃度（MIC），并利用實(shí)時熒光定量PCR檢測連翹脂苷A作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株后RND相關(guān)基因（aheA、aheB和aheC）的表達(dá)變化?！窘Y(jié)果】連翹提取液與64 μg/mL恩諾沙星聯(lián)合作用下，連翹提取液對嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC為3.12 μg/mL;在MIC和2MIC的條件下，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合作用能有效抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株的生長，24 h內(nèi)未見明顯的生長趨勢。連翹的3種有效成分對嗜水氣單胞菌耐藥菌株均表現(xiàn)出抑制作用，在1.00 μg/mL濃度條件下，連翹脂苷A的整體抑制效果較連翹苷和連翹脂苷B的效果更好。以1.00 μg/mL連翹脂苷A作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株后，aheA、aheB和aheC基因均呈不同程度的下調(diào)表達(dá)，其中aheA基因的相對表達(dá)量較連翹脂苷A作用前顯著下降（P<0.05）?！窘Y(jié)論】連翹提取液與適宜濃度的恩諾沙星聯(lián)合使用對嗜水氣單胞菌有明顯抑制效果，同時能延緩嗜水氣單胞菌的耐藥性，其中又以連翹脂苷A對RND主動外排系統(tǒng)的抑制作用最明顯。

關(guān)鍵詞： 連翹酯苷A;嗜水氣單胞菌;恩諾沙星;耐藥性;耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族（RND）

中圖分類號： S948? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0187-07

0 引言

【研究意義】隨著氟喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛使用，其耐藥問題越來越嚴(yán)重，且該類藥物在細(xì)菌體內(nèi)的主動外排作用極易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥（明德松和鄧勇，2013;李帆等，2018）。與細(xì)菌主動外排作用相關(guān)的超家族共有5個（Kerr，2002;Piddock，2006;Murakami et al.，2006），分別是ATP 結(jié)合盒超家族（ABC）、小多藥耐藥家族（SMR）、主要易化子超家族（MF）、多藥及毒性化合物外排家族（NATE）和耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族（RND）。AcrB是RND家族外排泵中的一個主要耐藥蛋白，位于細(xì)胞內(nèi)膜上。在膜融合蛋白（AcrA）和外膜通道蛋白（TolC）的協(xié)助下，AcrB蛋白通過自身提供的能量選擇性將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)排出到細(xì)胞質(zhì)周圍，同時在AcrA 蛋白的協(xié)助下傳遞給TolC，進(jìn)而將藥物分子徹底排出細(xì)胞外（Murakami et al.，2006）。這種外排泵方式即為大腸桿菌（Escherichia coli）多重耐藥性的主要耐藥機(jī)制，其作用底物大多為四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物（田亞凱，2018）。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要致病菌之一，能引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物急性出血性敗血癥而大批量死亡，且耐藥問題日趨嚴(yán)重，但至今有關(guān)外排泵RND耐藥機(jī)制在嗜水氣單胞菌中的報道很少，因此，亟待加強(qiáng)嗜水氣單胞菌外排泵RND耐藥機(jī)制研究，有效解決因嗜水氣單胞菌耐藥造成的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已從嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC796的全基因組中檢測到10個RND系統(tǒng)（Seshadri et al.，2006;Takahashi et al.，2014），其中7個屬于疏水/兩親外排-1家族系統(tǒng)（Saier and Paulsen，2001;Seshadri et al.，2006）。AheB是嗜水氣單胞菌中與大腸桿菌AcrB系統(tǒng)最密切相關(guān)的外排泵，且與銅綠假單胞菌（Pseudomas aeruginosa）中mexB的作用性質(zhì)相似（Evans and Poole，1999;Hernould et al.，2008;Kiratisin et al.，2012;Sader et al.，2017）。與其他外排泵相比，AheABC關(guān)鍵基因表達(dá)量的變化對耐藥菌的敏感性影響更明顯（Morita et al.，2001;Hernould et al.，2008），且該外排泵具有底物特異性。Hernould等（2008）發(fā)現(xiàn)的嗜水氣單胞菌AheABC外排泵是人類首次發(fā)現(xiàn)的氣單胞菌屬細(xì)菌存在外排泵多重耐藥系統(tǒng)，其至少能泵出13種物質(zhì)，包括9種抗生素;同時通過苯丙氨酸—精氨酸-β-萘酰胺（PAβN）抑制試驗(yàn)證實(shí)，除AheABC外排系統(tǒng)外還有其他的RND家族藥物外排系統(tǒng)參與嗜水氣單胞菌的自身耐藥過程。因此，以恩諾沙星作為模式藥物對病原菌RND系統(tǒng)進(jìn)行研究，對揭示嗜水氣單胞菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】連翹具有抗菌、抗病毒和抗氧化等作用，且成分復(fù)雜、作用靶位多、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，主要有效成分為苯乙醇苷類、木脂素類、揮發(fā)油類和三萜類（曲歡歡，2008;孟祥樂等，2010），其中苯乙醇苷類主要包括連翹苷和連翹脂苷，二者的作用效果迥異，即使同一有效成分對不同菌株耐藥性的抑制作用也有所差別，但至今鮮見有關(guān)連翹有效成分對菌株耐藥性影響的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過探究連翹3種有效成分（連翹苷、連翹脂苷A和連翹脂苷B）抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株的效果，并采用實(shí)時熒光定量PCR檢測連翹對藥物主動外排系統(tǒng)中RND相關(guān)基因表達(dá)的影響，為明確連翹延緩氟喹諾酮類藥物耐藥性的有效成分及揭示其延緩機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

對國家水生動物病原庫保存的嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC7966）進(jìn)行誘導(dǎo)以獲得耐藥菌株;連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯苷B（純度≥98%）購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;TRIzol Reagent（15596-026）購自美國Invitrogen公司;氯仿（批號10006818）、異丙醇（批號40064360）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RRO47A）購自TaKaRa公司。主要儀器設(shè)備有制冰機(jī)（XUEKE，IMS-100）、熒光定量儀（Roche，480II Real Time PCR System）、PCR儀（BioRad，C1000）、核酸定量儀（Thermo，NanoDrop 2000c）和離心機(jī)（Eppendrof，5810R）等。

1. 2 連翹有效成分溶液配制

精確稱取18.0 mg連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯苷B粉末（純度≥98%），充分溶解于900.0 μL二甲基亞砜（DMSO）中，配制成20 mg/mL的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾5次后4 ℃保存?zhèn)溆?。使用前以MH液體培養(yǎng)基稀釋成200 μg/mL，確保DMSO濃度低于1%（黃智生，2016）。

1. 3 連翹及其與恩諾沙星聯(lián)合作用最小抑菌濃度（MIC）測定

參考董亞萍等（2016）的方法提取連翹有效成分，再以MH液體培養(yǎng)基分別稀釋連翹提取物（1.0 g/L）和恩諾沙星（1280 μg/mL），配制成9個濃度梯度連翹提取液（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56和0.78 μg/mL），每個濃度梯度中的恩諾沙星濃度均為64 μg/mL;以只含64 μg/mL恩諾沙星的培養(yǎng)基為對照?；罨氖人畾鈫伟退幘暧脺缇睇}水稀釋制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?.0 μL菌懸液加入到96孔板中，且每孔添加200.0 μL藥液，每個濃度梯度設(shè)3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)20 h后觀察并記錄結(jié)果，以肉眼觀察培養(yǎng)基中無渾濁液所對應(yīng)的連翹提取液濃度即為MIC。

1. 4 嗜水氣單胞菌生長曲線測定

根據(jù)連翹提取物對嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC，取一定量的連翹提取物（1.0 g/mL）置于3只無菌錐形瓶中，以含64 μg/mL恩諾沙星的MH液體培養(yǎng)基補(bǔ)足至100.0 mL，分別制成含連翹提取物1/2MIC、MIC和2MIC的MH液體培養(yǎng)基;另取2只無菌錐形瓶，其中，只含64 μg/mL恩諾沙星MH液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶為陰性對照，不加任何藥物、只含MH液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶為陽性對照。5只錐形瓶均接種嗜水氣單胞菌耐藥菌株的對數(shù)菌懸液，28 ℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)，每隔1 h取適量菌液在600 nm下測定吸光值，然后以取菌液培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制耐藥菌株的生長曲線。

1. 5 不同連翹有效成分對耐藥菌的延緩效果

連翹的3種有效成分溶液用MH培養(yǎng)基分別稀釋為0.05、0.10、0.25、0.50和1.00 μg/mL 5個濃度梯度，將6株嗜水氣單胞菌耐藥菌株分別接種到不同濃度梯度中，同時設(shè)不含連翹有效成分的MH培養(yǎng)基為對照。28 ℃下?lián)u床（200 r/min）培養(yǎng)24 h后肉眼觀察結(jié)果，當(dāng)最低濃度的試管無細(xì)菌生長即為受試菌株對恩諾沙星的MIC，通過與原始MIC對比以判斷其延緩耐藥效果。

1. 6 菌株耐藥相關(guān)基因定量分析

1. 6. 1 引物設(shè)計與合成 選擇aheA、aheB和aheC 3個基因，根據(jù)基因位置在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）下載相關(guān)序列，然后采用Primer Premier 5.0設(shè)計擴(kuò)增引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 6. 2 菌液總RNA提取 取2.0 mL搖床培養(yǎng)16～20 h的菌懸液，4 ℃下12000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗脫2次，4 ℃下12000 r/min離心2 min。采用TRIzol Reagent提取菌液總RNA，并測定RNA濃度和質(zhì)量。5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，RNA 1 μg，RNase Free dH2O補(bǔ)足至10.0 μL，充分混勻，42 ℃下反應(yīng)2 min以去除基因組DNA。

1. 6. 3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系20.0 μL：RNA模板10.0 μL，Primer Script RT Enzyme MIX 1.0 μL，RT Primer MIX 1.0 μL，5×Prime Script Buffer 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1. 6. 4 實(shí)時熒光定量PCR檢測 以β-action基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，每組3個重復(fù)。反應(yīng)體系20.0 μL：2×SYBR Green Supermix 10.0 μL，Primer-F 1.0 μL，Primer-R 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-Free H2O 6.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，以GraphPad Prism 5.0制圖，并采用SPSS 22.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

1. 6. 5 連翹酯苷A對嗜水氣單胞菌耐藥菌株的作用 選擇連翹酯苷A的高、中、低3個濃度即0.05、0.50和1.00 μg/mL作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株，然后對aheA、aheB和aheC 3個基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 連翹與恩諾沙星聯(lián)合作用對嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC

不同濃度連翹提取液與64 μg/mL恩諾沙星聯(lián)合作用，隨連翹提取液濃度的升高，嗜水氣單胞菌耐藥菌株對聯(lián)合藥物的敏感性增強(qiáng)。由表2可知，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合作用下，連翹提取液對嗜水氣單胞菌耐藥菌株的MIC為3.12 μg/mL;連翹提取液濃度為1.56 μg/mL時，嗜水氣單胞菌耐藥菌株對恩諾沙星的敏感度呈中介。

2. 2 連翹與恩諾沙星聯(lián)合作用對嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長曲線的影響

嗜水氣單胞菌耐藥菌株在陽性對照組中，從第1 h開始生長，至第2 h呈現(xiàn)出明顯的生長趨勢，其生長過程可分為遲緩期、對數(shù)期和穩(wěn)定期。在陰性對照中，嗜水氣單胞菌耐藥菌株具有3個明顯的生長特征期，在前4 h生長不明顯，但從第4 h開始迅速生長，且生長速度與陽性對照組相近，說明該耐藥菌株對64 μg/mL恩諾沙星已產(chǎn)生耐藥性。在64 μg/mL恩諾沙星與1/2MIC連翹提取液的共同作用下，嗜水氣單胞菌耐藥菌株的生長明顯受到抑制，在前7 h無明顯生長，之后進(jìn)入正常生長狀態(tài)，即1/2MIC條件下恩諾沙星與連翹聯(lián)合作用并未完全抑制耐藥菌株生長。在MIC和2MIC的條件下，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合使用能有效抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長，24 h內(nèi)未見明顯的生長趨勢（圖1）。

2. 3 不同連翹有效成分的抑菌效果

由表3可知，連翹的3種有效成分對嗜水氣單胞菌耐藥菌株均表現(xiàn)出抑制作用，其中，連翹苷和連翹脂苷B的抑制效果均隨其濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，連翹脂苷A在0.25 μg/mL下即對嗜水氣單胞菌耐藥菌株生產(chǎn)明顯的抑制作用，但濃度繼續(xù)升高其抑制效果略有下降。在1.00 μg/mL濃度條件下，連翹脂苷A的整體抑制效果較連翹苷和連翹脂苷B的效果更好。

2. 4 連翹酯苷A作用前后耐藥相關(guān)基因表達(dá)量的變化

以1.00 μg/mL連翹脂苷A作用嗜水氣單胞菌耐藥菌株后，通過實(shí)時熒光定量PCR測定與RND相關(guān)基因（aheA、aheB和aheC）的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個目的基因均呈不同程度的下調(diào)表達(dá)，且以aheA基因的變化最明顯（圖2），呈顯著下降趨勢（P<0.05，下同）。由圖3可看出，經(jīng)0.05、0.50和1.00 μg/mL連翹脂苷A作用后，aheA基因的相對表達(dá)量均呈不同程度的下調(diào)趨勢，0.05和0.50 μg/mL濃度條件下aheA基因表達(dá)差異不顯著（P>0.05），而在1.00 μg/mL濃度條件下，aheA基因的相對表達(dá)量較連翹脂苷A作用前顯著下降。

3 討論

中藥不僅具有明顯的抗菌作用，還能延緩或抑制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生（胡梅等，2016）。王習(xí)達(dá)等（2011）研究表明，恩諾沙星與中藥蒲甘散聯(lián)合作用的抑菌效果明顯高于單一使用恩諾沙星，且以1∶6的配比效果最佳，對異育銀鯽敗血癥的治愈率最高。盧靜等（2013）對6種中藥和喹諾酮類藥物單體及兩兩聯(lián)合使用抑制嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的效果進(jìn)行對比，結(jié)果顯示抑菌效果排序?yàn)槁?lián)合配比>喹諾酮類單體>中草藥單體。胡梅等（2016）研究表明，淫羊藿水提取物與頭孢類抗菌藥聯(lián)用是通過協(xié)同或相加作用而提高抗菌藥對產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，但不宜與磺胺類和喹諾酮類聯(lián)合用藥。本研究將不同濃度的連翹提取液與64 μg/mL恩諾沙星聯(lián)合作用于嗜水氣單胞菌耐藥菌株，并檢測24 h內(nèi)耐藥菌株的生長趨勢，結(jié)果顯示在MIC和2MIC條件下，連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)合作用能有效抑制嗜水氣單胞菌耐藥菌株生長，24 h內(nèi)未見明顯的生長趨勢，與朱健銘等（2017）的研究結(jié)果相似。進(jìn)一步證實(shí)連翹具有延緩嗜水氣單胞菌耐藥性的作用，且與適宜濃度的恩諾沙星聯(lián)合作用其效果更明顯。

細(xì)菌在逆境脅迫下，其表面會形成一種生物被膜以抵御外界環(huán)境，如抗生素在抑制細(xì)菌生長的同時會誘導(dǎo)部分細(xì)菌形成生物膜。Qu等（2008）研究表明，黃連素等提取物可有效抑制耐藥菌生物膜形成;官妍等（2010）研究表明，黃芩對葡萄球菌生物膜的形成無抑制作用，而連翹苷可有效抑制葡萄球菌表皮生物膜形成，且隨連翹苷濃度的增加其抑制作用逐漸增強(qiáng);張穎娟等（2014）通過測定連翹有效成分對大腸桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等3種致病菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連翹苷對這3種致病菌無抑菌活性，而連翹酯苷A的抑菌效果排序?yàn)榇竽c桿菌>金黃色葡萄球菌>肺炎鏈球菌。本研究結(jié)果顯示，連翹的3種有效成分對嗜水氣單胞菌耐藥菌株均有不同程度的抑制作用，與孟祥樂等（2015）、Yan等（2017）的研究結(jié)果相似。相對于連翹的其他兩種有效成分（連翹苷和連翹脂苷B），連翹酯苷A的抑菌作用和延緩耐藥性效果更明顯。但鐘海琴（2013）在研究連翹苷、連翹脂苷A和連翹酯苷B對肺炎克雷伯氏菌外排泵的影響時，發(fā)現(xiàn)連翹脂苷B對肺炎克雷伯氏菌耐藥菌株的抑制作用最強(qiáng)，可能是由于連翹的作用靶位較多，且對不同致病菌的作用機(jī)制不同，即要求進(jìn)一步探究連翹對耐藥菌的抑制機(jī)制。

中藥對細(xì)菌及其耐藥性抑制的作用機(jī)制較復(fù)雜，主要是通過抑制細(xì)菌生物被膜的形成而延緩細(xì)菌對抗菌藥的耐藥性（官妍等，2010;黃干榮等，2013）。任玲玲和關(guān)立增（2008）通過對比連翹作用大腸桿菌耐藥菌株前后的基因組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹可改變與藥物外排作用相關(guān)的基因。AcrABC外排系統(tǒng)是大腸桿菌的主要多重耐藥機(jī)制，而嗜水氣單胞菌aheB基因與大腸桿菌主要外排系統(tǒng)的acrB基因功能極其相似。本研究結(jié)果表明，以1.00 μg/mL連翹脂苷A作用嗜水氣單胞菌耐藥菌株后，aheA、aheB和aheC基因均呈不同程度的下調(diào)表達(dá)，且以aheA基因的變化最明顯;此外，經(jīng)0.05、0.50和1.00 μg/mL連翹脂苷A作用后，aheA基因相對表達(dá)量也呈不同程度的下調(diào)趨勢，其中在1.00 μg/mL濃度條件下，aheA基因的相對表達(dá)量較連翹脂苷A作用前顯著下降。連翹酯苷A延緩嗜水氣單胞菌對恩諾沙星耐藥性的同時，一定程度上降低了與RND外排作用相關(guān)基因的表達(dá)，其作用機(jī)制是否與其他機(jī)制相關(guān)尚需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

連翹提取液與適宜濃度的恩諾沙星聯(lián)合使用對嗜水氣單胞菌有明顯抑制效果，同時能延緩嗜水氣單胞菌的耐藥性，其中又以連翹脂苷A對RND主動外排系統(tǒng)的抑制作用最明顯。

參考文獻(xiàn)：

董亞萍，謝欣燕，胡鯤，楊先樂. 2016. 中草藥延緩嗜水氣單胞菌對恩諾沙星耐藥性的研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，（12）：1-4. [Dong Y P，Xie X Y，Hu K，Yang X L. 2016. Effects of Chinese herbal medicine on Aeromonas hydrophila resistance on enrofloxacin[J]. Hunan Agricultural Sciences，（12）：1-4.]

官妍，謝萌，汪長中，程惠娟，張爽，馬越，云云. 2010. 連翹苷和黃芩苷對表皮葡萄球菌生物膜抑制作用的研究[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，22（10）：886-889. [Guan Y，Xie M，Wang C Z，Cheng H J，Zhang S，Ma Y，Yun Y. 2010. Inhibitory activity of phillyrin and baicalin against Staphylococcus epidermidis biofilm[J]. Chinese Journal of Microecology，22（10）：886-889.]

胡梅，梁政，黎天良，秦風(fēng)偉，羅遠(yuǎn)燕，吳永繼，劉增援，趙雨川，司紅彬. 2016. 淫羊藿水提取物聯(lián)合抗菌藥對耐藥大腸桿菌的體外抑制效果[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，47（10）：1778-1783. [Hu M，Liang Z，Li T L，Qin F W，Luo Y Y，Wu Y J，Liu Z Y，Zhao Y C，Si H B. 2016. In vitro inhibi-tory effect of Epimedium brevicornu Maxim. water extract combined with antimicrobials on drug-resistant Escherichia coli[J]. Journal of Southern Agriculture，47（10）：1778-1783.]

黃干榮，李曉華，黃衍強(qiáng)，黃小風(fēng)，韋連登，韋紅玉，陳源紅，唐華英，楊珊，覃艷春. 2013. 大黃素等提取物對耐藥性大腸桿菌生物膜形成的影響[J]. 中成藥，35（12）：2602-2605. [Huang G R，Li X H，Huang Y Q，Huang X F，Wei L D，Wei H Y，Chen Y H，Tang H Y，Yang S，Qin Y C. 2013. Effect of emodin and like on biofilm formation of antibiotic resistant Escherichia coli[J]. Chinese Traditional Patent Medicine，35（12）：2602-2605.]

黃智生. 2016. 黃芩苷聯(lián)合連翹苷對甲型流感病毒核蛋白基因表達(dá)影響的體外實(shí)驗(yàn)研究[D]. 南昌：南昌大學(xué). [Huang Z S. 2016. Effect of Baicalin combined with Phillyrin on gene expression of influenza A virus nucleoprotein（NP） in vitro[D]. Nanchang：Nanchang University.]

李帆，羅行煒，劉建華，梁軍，賀丹丹，潘玉善，苑麗，胡功政. 2018. 豬源沙門氏菌多藥外排泵oqxAB和氟苯尼考耐藥基因floR的檢測分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，30（11）：82-85. [Li F，Luo X W，Liu J H，Liang J，He D D，Pan Y S，Yuan L，Hu G Z. 2018. Detection and analysis of multidrug e-fflux pump oqxAB and florfenicol-tolerant gene floR in swine-derived Salmonella typhimurium[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（11）：82-85.]

盧靜，王振寧，陳銳，關(guān)爽. 2013. 幾種中藥單體和抗生素對嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌的體外抑菌活性研究[J]. 水生生物學(xué)報，37（6）：1129-1131. [Lu J，Wang Z N，Chen R，Guan S. 2013. In vitro antibacterial activity of several Chinese medicine monomers and antibiotics on Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，37（6）：1129-1131.]

孟祥樂，郭艷麗，蘇成福，黃海英，桂新景，李學(xué)林. 2015. 連翹脂苷A抑制Caco-2細(xì)胞膜上P-糖蛋白的外排功能及作用機(jī)制探討[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，21（17）：5-8. [Meng X L，Guo Y L，Su C F，Huang H Y，Gui X J，Li X L. 2015. Discussion of inhibitory of forsythoside A on efflux function and mechanism of P-glycoprotein in Caco-2 cell membrane[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，21（17）：5-8.]

孟祥樂，李俊平，李丹，孫習(xí)鵬，李顏，余奇，萬麗麗，郭澄. 2010. 連翹的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國藥房，21（43）：4117-4119. [Meng X L，Li J P，Li D，Sun X P，Li Y，Yu Q，Wan L L，Guo C. 2010. Research on progress of chemical constituents and pharmacological activities of Forsythia Suspensa[J]. China Pharmacy，21（43）：4117-4119.]

明德松，鄧勇. 2013. 國內(nèi)銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的Meta分析[J]. 中國循證醫(yī)學(xué)雜志，13（10）：1215-1218. [Ming D S，Deng Y. 2013. Resistance of Pseudomonas aeruginosa to quinolone in China：A meta-analysis[J]. Chinese Journal of Evidence-Based Medicine，13（10）：1215-1218.]

曲歡歡. 2008. 連翹化學(xué)成分和生物活性研究[D]. 西安：西北大學(xué). [Qu H H. 2008. Chemical constituents of Forsythia suspense and bioactivity study[D]. Xi’an：Northwest University.]

任玲玲，關(guān)立增. 2008. 連翹對大腸埃希菌多重耐藥基因AcrA的影響研究[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，29（5）：43-45. [Ren L L，Guan L Z. 2008. Effect of Chinese traditional medicine weeping forsythia on multidrug resistance gene AcrA of the E. coli[J]. Progress in Veterinary Medicine，29（5）：43-45.]

田亞凱. 2018. 犬源大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測及藥物敏感性分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，30（4）：79-82. [Tian Y K. 2018. Detection of plasmid-media-ted quinolone-resistant genes in Escherichia coli isolated from dogs and analysis of their drug sensitivity[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（4）：79-82.]

王習(xí)達(dá)，陳輝，沙莎，劉訓(xùn)猛，吳國榮. 2011. 恩諾沙星配伍蒲甘散對異育銀鯽敗血癥的療效研究[J]. 南京師大學(xué)報（自然科學(xué)版），34（1）：86-88. [Wang X D，Chen H，Sha S，Liu X M，Wu G R. 2011. Study on curative effect of enrofloxacin compound with Pu powder to bacterial septicemi of Carassius auratus gibelio[J]. Journal of Nanjing Normal University（Natural Science Edition），34（1）：86-88.]

張穎娟，韓燕霞，梁利鵬，尚彩玲，薛慧清. 2014. 青翹正丁醇部位連翹苷、連翹酯苷A的制備及抑菌、抗氧化活性[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，20（21）：192-196. [Zhang Y J，Han Y X，Liang L P，Shang C L，Xue H Q. 2014. Preparation and antibacterial antioxidant activity of phillyrin，forsythiaside A on n-butanol part extract from Qingqiao of Forsythia suspense[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，20（21）：192-196.]

鐘海琴. 2013. 連翹酯苷B對肺炎克雷伯菌外排泵活性的影響[D]. 寧波：寧波大學(xué). [Zhong H Q. 2013. Effect of forsythoside B on efflux pump activity of Klebsiella pneumoniae[D]. Ningbo：Ningbo University.]

朱健銘，翁幸鐾，姜如金，吳晉蘭，賀子龍，姚娜. 2017. 黃芩水煎劑對尿道致病性大腸埃希菌的轉(zhuǎn)錄組影響分析[J]. 中草藥，48（9）：1791-1801. [Zhu J M，Weng X B，Jiang R J，Wu J L，He Z L，Yao N. 2017. Effect analysis on water decoction of Scutellaria baicalensis to transcription of uropathogenic Escherichia coli[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，48（9）：1791-1801.]

Evans K，Poole K. 1999. The MexA-MexB-OprM multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa is growth-phase regulated[J]. FEMS Microbiology Letters，173（1）：35-39.

Hernould M，Gagné S，F(xiàn)ournier M，Quentin C，Arpin C. 2008. Role of the AheABC efflux pump in Aeromonas hydrophi-la intrinsic multidrug resistance[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，52（4）：1559-1563.

Kerr I D. 2002. Structure and association of ATP-binding ca-ssette transporter nucleotide-binding domains[J]. Biochi-mica et Biophysica Acta，1561（1）：47-64.

Kiratisin P，Chongthaleong A，Tan T Y，Lagamayo E，Roberts S，Garcia J，Davies T. 2012. Comparative in vitro activity of carbapenems against major Gram-negative pathogens： Results of Asia-Pacific surveillance from the COMPACT II study[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，39（4）：311-316.

Morita Y，Komori Y，Mima T，Kuroda T，Mizushima T，Tsuchiya T. 2001. Construction of a series of mutants lacking all of the four major mex operons for multidrug efflux pumps or possessing each one of the operons from Pseudomonas aeruginosa PAO1： MexCD-OprJ is an induci-ble pump[J]. FEMS Microbiology Letters，202（1）：139-143.

Murakami S，Nakashima R，Yamashita E，Matsumoto T，Yamaguchi A. 2006. Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism[J]. Nature，443（7108）：173-179.

Piddock L J V. 2006. Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria[J]. Clinical Microbiology Reviews，19（2）：382-402.

Qu H，Zhang Y，Wang Y，Li B，Sun W. 2008. Antioxidant and antibacterial activity of two compounds（forsythiaside and forsythin） isolated from Forsythia suspensa[J]. The Journal of Pharmacy and Pharmacology，60（2）：261-266.

Sader H S，Huband M D，Castanheira M，F(xiàn)lamm R K. 2017. Antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa：Results from four years（2012-2015） of the International Network for Optimal Resistance Monitoring（INFORM） program in the United States[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，61（3）：pii： e02252-16.doi：10.1128/AAC. 02252-16.

Saier M H Jr，Paulsen I T. 2001. Phylogeny of multidrug transporters[J]. Seminars in Cell & Developmental Bio-logy，12（3）：205-213.

Seshadri R，Joseph S W，Chopra A K，Sha J，Shaw J，Graf J，Haft D，Wu M，Ren Q，Rosovitz M J，Madupu R，Tallon L，Kim M，Jin S，Vuong H，Stine O C，Ali A，Horneman A J，Heidelberg J F. 2006. Genome sequence of Aeromonas hydrophila ATCC 7966T：Jack of all trades[J]. Journal of Bacteriology，188（23）：8272-8282.

Takahashi E，Ozaki H，F(xiàn)ujii Y，Kobayashi H，Yamanaka H，Arimoto S，Negishi T，Okamoto K. 2014. Properties of hemolysin and protease produced by Aeromonas trota[J]. PLoS One，9（3）：e91149.

Yan X，Chen T，Zhang L，Du L. 2017. Protective effects of forsythoside A on amyloid beta-induced apoptosis in PC12 cells by downregulating acetylcholinesterase[J]. European Journal of Pharmacology，810：141-148.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）