姚笛，徐磊，佐兆杭，侯婷婷，郭瑜

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

0 引言

牛乳營養(yǎng)價值較高，同時易遭受致病菌污染[1]。沙門氏菌屬（Salmonella）[2]可污染食品，引發(fā)食物中毒。據(jù)統(tǒng)計，沙門氏菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒中位列榜首[3-6]。因此，建立一種快速的沙門氏菌檢測方法尤為重要。目前，沙門氏菌檢測方法有培養(yǎng)法、免疫法和PCR方法等[7，8]，國家標準規(guī)定的沙門氏菌檢測方法為微生物培養(yǎng)法，該方法存在操作時間長、特異性和靈敏度低等缺點[9-11]，免疫學方法由于非特異性吸附易出現(xiàn)假陽性，而PCR方法不能對樣品進行定量分析[12-13]。invA是沙門氏菌的保守基因，有研究利用PCR方法對動物性食品的invA基因進行了特異性擴增[14-17]。因此，本研究建立一種牛乳中沙門氏菌invA基因的熒光定量PCR快速檢測方法，為牛乳中致病菌的快速檢測提供方法學參考。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株

沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌等菌種為黑龍江八一農墾大學食品生物技術實驗室保存；載體PMD-18 T載體。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基，TaKaRa ExTaqTM（5 U/μL），rTaq（5 U/μL），MgCl2（25 mmol/L），dNTPs（10 mmol/L），DL2000DNAMarker，6×Loading Buffer，SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）等；細菌基因組DNA和質粒抽提等試劑盒。

1.1.3 主要儀器

PCR基因擴增儀（9700型），凝膠成像系統(tǒng)（YJ600+型），Real-Time PCR儀（Line-Gene K型），臺式離心機（TGL-16B）。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和DNA模板的制備

將沙門氏菌菌種接種于LB固體培養(yǎng)基中進行活化，37℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落接種LB液體培養(yǎng)基，轉速為180 r/min，37℃培養(yǎng)12 h。離心獲得菌體后提取菌體DNA，具體操作按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行。

1.2.2 引物的合成

根據(jù)GenBank中的沙門氏菌的invA基因序列，利用Primer 5軟件設計符合熒光定量PCR擴增要求的特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，預期擴增片段大小約為190 bp。引物序列如下：

上游引物為5'-CGCTCTTTCGTCTGGCATT-3'；

下游引物為5'-GACCACGGTGACAATAGAG-3'。

1.2.3 目的基因的擴增和克隆

利用沙門氏菌的invA基因特異性引物，以提取的菌體DNA為模板進行目的基因的PCR擴增，擴增條件為：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，經30個循環(huán)；72℃10 min。擴增后的目的片段利用膠回收試劑盒進行純化，具體操作見說明書。擴增和純化后的目的片段經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。然后將純化后的目的基因與p MD-18 T載體連接，轉化E.coli DH 5α感受態(tài)細胞，具體操作按照說明書進行，獲得目標基因的克隆載體pMD-18 T-invA，提取重組質粒并進行PCR鑒定，將鑒定正確的質粒進行測序。

1.2.4 重組質粒標準曲線的繪制

測定重組質粒濃度并計算拷貝數(shù)，然后對重組質粒進行10倍系列稀釋，以不同稀釋倍數(shù)的質粒為模板進行定量PCR擴增[18]。定量PCR的反應體系為：SYBR Premix Ex Tap（2X）（Tli RNaseH Plus）12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 10.5μL。反應條件為94℃（30 s）滅活酶，95℃（5 s）變性，60℃（20 s）退火、延伸，擴增45個循環(huán)。反應結束后，系統(tǒng)自動形成標準曲線。

1.2.5 特異性檢測

利用建立的熒光定量PCR檢測方法，以invA基因的上、下游引物分別對沙門氏菌及其他3種牛乳中常見致病菌（大腸桿菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌）同時進行擴增，進一步確定建立的沙門氏菌熒光定量PCR檢測方法的特異性。

1.2.6 靈敏性檢測

對確定濃度的沙門氏菌DNA進行10倍系列稀釋，以不同濃度的DNA為模板進行擴增，測定其靈敏性。

1.2.7 模擬標本的檢測

對沙門氏菌菌液進行10倍系列稀釋，測定菌落總數(shù)，牛乳滅菌后摻入一定數(shù)量的沙門氏菌，分別為4.42×104，4.42×103，4.42×102，44.2 mL-1；混勻后提取牛乳的基因組DNA，然后相同條件下以DNA為模板進行擴增。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌invA基因片段的PCR擴增結果與序列分析

沙門氏菌invA基因片段的PCR擴增結果如圖1所示，重組質粒的鑒定結果如圖2所示。由圖1和圖2可以看出，片段大小對應Marker 200 bp處，與預期擴增片段大小相符合。重組質粒的測序結果經BLAST比對后發(fā)現(xiàn)與沙門氏菌invA基因的同源性為100%。圖中，M為DL2000 DNA Marker；1為沙門氏菌invA基因重組質粒的PCR擴增產物。

圖1 invA基因的PCR擴增

圖2 invA基因重組質粒的PCR鑒定結果

2.2 熒光定量PCR擴增結果

測定沙門氏菌invA基因重組質粒的質量濃度為56.9 ng/uL，對重組質粒進行系列稀釋，濃度分別為1×105，1×106，1×107，1×108，1×109拷貝數(shù)/μL，以稀釋的不同濃度質粒為模板進行熒光定量PCR擴增，獲得擴增曲線，如圖3所示。

依據(jù)上述質粒模板的擴增曲線，以不同拷貝的質粒模板的對數(shù)為橫坐標，以擴增的循環(huán)數(shù)為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖4所示，獲得的標準曲線方程為y=-3.334x+38.15，R2為0.9883，當質粒濃度在105～109拷貝數(shù)/μL時，質粒濃度與擴增循環(huán)數(shù)的線性關系較好。

不同濃度質粒模板的擴增熔解曲線如圖5所示。由圖5可以看出，不同濃度質粒模板的擴增產物的溶解溫度均為84.7℃。

圖4 標準模板的標準曲線

圖5 標準模板的qRT-PCR熔解曲線

2.3 熒光定量PCR的特異性檢測

以invA基因的上下游引物對沙門氏菌等4種牛乳中常見致病菌模板進行熒光定量PCR擴增，結果如圖6所示。由圖6可以看出，只獲得一條沙門氏菌的擴增曲線，其他3種致病菌未見特異性擴增，即無交叉反應現(xiàn)象，因此，建立的沙門氏菌的熒光定量PCR方法的特異性較好。

圖6 qRT-PCR特異性檢測

2.4 熒光定量PCR的靈敏性檢測

將沙門氏菌DNA分別稀釋成質量濃度為1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7ng/μL；以不同質量濃度的DNA為模板進行擴增，擴增曲線如圖7所示。由圖7可以看出：其最低檢出限為1×10-7ng/μL，即當DNA質量濃度只有1×10-7ng/μL時，根據(jù)公式拷貝數(shù)/μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)計算出拷貝數(shù)為32.44拷貝數(shù)/μL時仍然能夠檢測到，說明建立的沙門氏菌qRT-PCR檢測方法的靈敏性較好。

圖7 沙門氏菌的qRT-PCR靈敏性檢測

2.5 摻菌乳樣的檢測

在滅菌的牛乳中摻入不同菌落總數(shù)的沙門氏菌，使牛乳中菌的含量分別為4.42×104，4.42×103，4.42×102，44.2 mL-1；利用建立的方法進行檢測，結果如圖8所示。

圖8 模擬標本的熒光定量PCR擴增曲線

由圖8可以看出：當乳中沙門氏菌的含量只有44.2 mL-1時，仍可獲得擴增曲線，同時根據(jù)國標方法（GB 4789.4-2016）檢測摻有相同菌落數(shù)的沙門氏菌，僅能夠檢測到4.42×102mL-1，說明建立的檢測方法的靈敏性好于國家標準。

3 討論

有關牛乳的細菌污染一直是重點檢測項目，特別是對腸道致病菌沙門氏菌的檢測[19]。沙門氏菌是一種常見的重要人畜共患病原菌，它不僅能導致雞白痢、仔豬副傷寒、流產等動物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、敗血癥、食物中毒和胃腸炎。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病多例占首位[20]。沙門氏菌作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均有重要意義。但沙門氏菌有3 000個以上的血清型及復雜的各類生化反應型，使常規(guī)檢驗程序復雜繁瑣、耗時費力，不僅給檢驗部門帶來沉重的負擔，而且還使生產部門產品運輸和倉儲的時間延長，費用增加[21-22]。因此靈敏度高、特異性強、重復性好、簡易、經濟的檢測方法是發(fā)展的方向。

以沙門氏菌侵襲蛋白基因invA作為擴增目標，該基因在幾乎所有血清型沙門氏菌中高度保守，Upadhyay利用PCR方法擴增了19種不同沙門氏菌血清型的invA基因中284bp片段，均獲得特異性擴增[23]。因此，本研究選擇特異性序列進行引物合成，結合熒光定量PCR的引物設計要求，選擇了擴增片段大小為149 bp的invA引物，結果表明該引物具有良好的特異性。通過試驗不斷篩選合適的引物濃度、PCR反應體系、退火溫度等條件，可以保證PCR的穩(wěn)定性和可重復性。熒光定量PCR檢測沙門氏菌的全部操作過程需要4 h左右，不僅大大提高了工作效率，并且除去需加樣的步驟外，其他的全部過程都在密閉的PCR管中完成，可以有效的避免由外界環(huán)境帶來的誤差。具有的快速、準確、靈敏度高、操作簡便、特異性好等特點?？赏酵瓿稍S多個樣品的同時擴增及定量，適宜于大批樣品的檢測處理，極大地提高了檢測時限，為食品污染的監(jiān)測和食物中毒事件的快速反應提供了技術支持。盡管實時定量PCR檢測設備較昂貴，但由于其能對樣品中細菌污染進行定量，且靈敏度高于傳統(tǒng)PCR，更易于自動化，必然會成為細菌檢測的常規(guī)手段。