陸延，邵曉園，李高聰，盧興，劉鳳錦，張軍

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500）

0 引言

含乳飲料是一類(lèi)品質(zhì)均一、清香純正、營(yíng)養(yǎng)與保健功能集于一體的液態(tài)蛋白飲品[1]。目前全球乳酸菌飲料的市場(chǎng)規(guī)模已達(dá)500億美元。歐美及日本等國(guó)家，發(fā)酵型乳酸菌飲品在乳制品市場(chǎng)的占有率高達(dá)90%。我國(guó)乳酸菌奶飲品正處于高速發(fā)展階段。根據(jù)尼爾森數(shù)據(jù)得知，從13年開(kāi)始我國(guó)乳酸菌飲料市場(chǎng)呈大幅增長(zhǎng)，截止2017年平均復(fù)合增長(zhǎng)率為28.9%，最高達(dá)到過(guò)50%。2017年銷(xiāo)售額為176.5億，已成為乳酸菌飲料的第二大市場(chǎng)。但是，發(fā)酵過(guò)程影響了酪蛋白的顆粒大小，而穩(wěn)定性又與粒徑大小、黏度等有關(guān)。因此，乳蛋白在酸性條件下的變性沉淀則一直是影響酸性乳飲料生產(chǎn)及開(kāi)發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題。近年來(lái)對(duì)多糖與乳蛋白的相互作用以及對(duì)最終產(chǎn)品穩(wěn)定性的研究已成為世界各國(guó)乳品科學(xué)和工程研究的一個(gè)主要方面[2]。乳酸菌胞外多糖通過(guò)與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，影響蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，從而在較低濃度下對(duì)酸乳的黏度、粘彈性、持水力、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等產(chǎn)生顯著影響，改善酸乳品質(zhì)[3-5]。

近年來(lái)，乳酸菌飲料口感特征不斷由黏稠型向清爽型發(fā)展，大豆多糖和高甲氧基果膠單獨(dú)或配合使用使這一性狀得以實(shí)現(xiàn)[3，6-10]。

本文以清爽型乳酸菌飲料為研究對(duì)象、離心沉淀率為檢測(cè)指標(biāo)，比較分析了添加和不添加大豆多糖條件下發(fā)酵乳黏度對(duì)乳酸菌飲料蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，探討影響乳酸菌飲料蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的新因素，以便更好實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵劑的產(chǎn)黏類(lèi)型選擇及乳酸菌飲料穩(wěn)定性控制。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

鮮牛奶（雙城市君宇牛奶養(yǎng)殖有限公司），可溶性大豆多糖（山東聚源生物科技有限公司），低黏度發(fā)酵劑（上海昊岳實(shí)業(yè)有限公司），高黏度發(fā)酵劑（黑龍江百錦生物工程有限公司），中黏度發(fā)酵劑（高粘度發(fā)酵劑與低粘度發(fā)酵劑1∶1配比），白砂糖，檸檬酸。

1.2 儀器與設(shè)備：

恒溫水浴鍋（鄭州市煜城儀器有限公司），電子天平(杭州萬(wàn)特衡器有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），高剪切乳化均質(zhì)機(jī)（SRH-S實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)機(jī)），離心機(jī)（XiangYi-H 1650），PH記（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

按照如下工藝方法分別應(yīng)用3種產(chǎn)黏能力發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳。

1.3.2 乳酸菌飲料調(diào)配與制備

按照如下過(guò)程，分別以3種不同黏度發(fā)酵乳為基料按下述工藝方法制備乳酸菌飲料。其中，組1不添加穩(wěn)定劑；組2添加水溶性大豆多糖作為穩(wěn)定劑，借鑒邵丹丹和曾令平等[3，6-10]關(guān)于大豆多糖在酸性含乳飲料中應(yīng)用技術(shù)研究方法，確定添加量為4%，高壓均質(zhì)條件為（一級(jí)壓力：30 MPa，二級(jí)壓力：15 MPa）。

1.3.3 操作要點(diǎn)

⑴原料液的制備

生牛乳在水浴鍋中加熱60℃，加入6%白砂糖充分?jǐn)嚢枞芙猓?0℃、殺菌15 min左右，冷卻至42℃接種發(fā)酵劑，恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵至酸奶p H為4.6終止發(fā)酵，放入冰箱冷藏后熟。

⑵穩(wěn)定液的制備

穩(wěn)定劑與10%的白砂糖、3%檸檬酸充分干混，溶于70℃蒸餾水中，攪拌10 min至充分溶解（溶液中沒(méi)有大塊顆粒存在），90℃以上殺菌3 min，冷卻至室溫備用。

⑶飲料調(diào)配與制備

將酸奶基料與穩(wěn)定劑溶液按1∶2比例（產(chǎn)品p H約4.3），采用實(shí)驗(yàn)室高剪切乳化機(jī)，15 000 r、7 min進(jìn)行剪切混合后，高壓均質(zhì)（一級(jí)壓力：30 MPa，二級(jí)壓力：15 MPa技術(shù)條件），罐裝制成發(fā)酵型乳酸菌飲料。

1.3.4 離心沉淀率的測(cè)定

取30 mL樣液放入離心管中，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，去除上清液，將離心管倒置10 min后擦去管口的水珠，稱(chēng)量底部沉淀物重量，計(jì)算離心沉淀率[11]。

M1—離心管質(zhì)量

M2—離心前樣品加離心管質(zhì)量

M3—離心后離心管加沉淀物質(zhì)量

離心沉淀率=（M3-M1）/（M2-M1）×100%

1.3.5 黏度測(cè)定

根據(jù)所測(cè)液體的黏度范圍選擇適合的轉(zhuǎn)子，用黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，本次實(shí)驗(yàn)選擇63號(hào)轉(zhuǎn)子，待數(shù)字第一次穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)黏能力發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳及乳酸菌飲料黏度

采用不同產(chǎn)黏能力的發(fā)酵劑制備的發(fā)酵乳以及以此發(fā)酵乳為基料制備的乳酸菌飲料黏度結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3種發(fā)酵乳及乳酸菌飲料黏度

圖中結(jié)果顯示，不同產(chǎn)黏能力發(fā)酵劑發(fā)酵相同牛乳，制備的發(fā)酵乳及乳酸菌飲料，黏度指標(biāo)差異顯著，各組中低黏度與中等黏度差值及中等黏度與高黏度差值分別為，發(fā)酵乳：23.70 mPa's和14.10 mPa's，變化率為46.11%和18.77%；無(wú)穩(wěn)定劑飲料組1∶12.80 mPa's和5.70 mPa's，變化率為72.73.11%和18.75%；添加穩(wěn)定劑飲料組2：15.50 mPa's和4.80 mPa's，變化率為126.02%和17.27%。雖然由于稀釋作用使得飲料黏度降低，但是組內(nèi)各項(xiàng)依然存在明顯差異。表明原料黏度特性對(duì)飲料的黏度特性有決定性影響，原料黏度高，以其制備的乳酸菌飲料黏度相應(yīng)也高。圖中數(shù)據(jù)也表明組2各項(xiàng)黏度比組1相應(yīng)降低，且原料黏度越低，其下降強(qiáng)度越大。

2.2 不同黏度發(fā)酵乳制備乳酸菌飲料離心沉淀率

不同黏度發(fā)酵乳制備乳酸菌飲料離心沉淀率分析結(jié)果如下圖2所示。

圖2 乳酸菌飲料離心沉淀率

圖2 為不同黏度發(fā)酵乳制備的乳酸菌飲料的離心沉淀率對(duì)比圖。由圖看出不添加穩(wěn)定劑的條件下，3種不同黏度發(fā)酵乳制備的乳酸菌飲料離心沉淀率有明顯差別，沉淀率分別為2.31%、3.35%和4.24%。黏度越大的發(fā)酵乳制備的乳酸菌飲料離心沉淀率越高，低黏度發(fā)酵乳制備的乳酸菌飲料離心沉淀率更低，沉淀率和發(fā)酵乳基料黏度正相關(guān)。相同工藝條件下，加入0.4%的大豆多糖作為穩(wěn)定劑制備的乳酸菌飲料，離心沉淀率分別為0.26%、0.73%和0.85%。該組也明顯表明離心沉淀率同樣與發(fā)酵乳基料黏度正相關(guān)，低黏度發(fā)酵乳制備的乳酸菌飲料離心沉淀率更低、穩(wěn)定性更好。上述結(jié)果表明乳酸菌飲料蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受發(fā)酵乳基料黏度的影響明顯，發(fā)酵乳基料黏度越大，用其制備的乳酸菌飲料離心沉淀率也越大，反之則越小，飲料穩(wěn)定性就越高。

2.3 發(fā)酵乳基料黏度對(duì)乳酸菌飲料沉淀率影響

發(fā)酵乳黏度對(duì)兩組乳酸菌飲料離心沉淀率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 發(fā)酵乳基料黏度與無(wú)穩(wěn)定劑飲料組沉淀率的關(guān)系

圖3 顯示，基料黏度對(duì)乳酸菌飲料沉淀率有明顯影響，隨著發(fā)酵乳黏度的降低，乳酸菌飲料沉淀率顯著下降，且黏度越低，下降幅度越大。當(dāng)發(fā)酵乳基料黏度由89.2 mPa's下降到75.1 mPa's時(shí)，乳酸菌飲料離心沉淀率由4.24%下降到3.35%，變化率6.31%，表明基料黏度每提高100 mPa's，所制作的乳酸菌飲料離心沉淀率就上升6.31各百分點(diǎn)。當(dāng)發(fā)酵乳基料黏度由75.1 mPa's下降到51.4 mPa's時(shí)，離心沉淀率由3.35%下降到2.31%，變化率4.39%；表明基料黏度每提高100 mPa's，所制作的飲料離心沉淀率就上升4.39各百分點(diǎn)。上述結(jié)果表明，僅以發(fā)酵乳基料，不添加大豆多糖做為穩(wěn)定劑制作乳酸菌飲料時(shí)，基料由高黏度向中等黏度變化比基料黏度由中等向低黏度變化對(duì)離心沉淀率影響更明顯。

圖4 發(fā)酵乳基料黏度與添加穩(wěn)定劑飲料組沉淀率關(guān)系

圖4 顯示，基料黏度對(duì)乳酸菌飲料沉淀率有明顯影響，隨著發(fā)酵乳黏度的降低，乳酸菌飲料沉淀率顯著下降，且黏度越低，下降幅度越大。當(dāng)發(fā)酵乳基料黏度由89.2 mPa's下降到75.1 mPa's時(shí)，乳酸菌飲料離心沉淀率由0.85%下降到0.73%，變化率0.85%，表明基料黏度每提高100 mPa's，所制作的乳酸菌飲料離心沉淀率就上升0.85各百分點(diǎn)。當(dāng)發(fā)酵乳基料黏度由75.1 mPa's下降到51.4 mPa's時(shí)，離心沉淀率由0.73%下降到0.26%，變化率1.98%；表明基料黏度每提高100 mPa's，所制作的飲料離心沉淀率就上升1.98各百分點(diǎn)。上述結(jié)果表明以大豆多糖為穩(wěn)定劑制作乳酸菌飲料時(shí)，基料由高黏度向中等黏度變化比基料由中等黏度向低黏度變化對(duì)離心沉淀率影響明顯減弱，基料黏度越低，穩(wěn)定作用越明顯。

3 討論

離心沉淀率是評(píng)價(jià)含乳飲料穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)，直接反應(yīng)了飲料的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。離心沉淀率越高，穩(wěn)定性越差，反之，越穩(wěn)定。

根據(jù)Stokes沉降速度方程V=2g r2(ρ1－ρ2)/9η，可知：顆粒的沉降速度與顆粒半徑r的平方、分散介質(zhì)和懸浮顆粒的密度差ρ成正比，與溶液黏度η成反比。因此要提高穩(wěn)定性，即要盡可能地降低顆粒的沉降速度V，使其無(wú)限趨近于零，一般采取三種策略：一是減少顆粒半徑r；二是減小密度差；三是增加分散相黏度。本研究結(jié)果顯示料液黏度高時(shí)，沉降率反而增大，與Stokes沉降速度方程矛盾。

羅靈泉研究發(fā)現(xiàn)酸乳的硬度隨胞外多糖含量的升高而降低，但其黏聚性隨含量的升高而升高，并發(fā)現(xiàn)：胞外多糖存在時(shí)，酸乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中孔較大、蛋白簇較厚、凝膠較密；而不產(chǎn)胞外多糖的酸乳結(jié)構(gòu)中孔較小且單一，蛋白簇較薄。原因可能是相同的條件下粘性酸乳中乳酸菌分泌的胞外多糖分子量較大，對(duì)酪蛋白形成的立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響力也明顯增大，該情況下形成的凝膠骨架結(jié)構(gòu)較細(xì)，網(wǎng)孔較小。

Ayala-Hernandez等[12]利用掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)酸乳體系中胞外多糖并不是簡(jiǎn)單地覆蓋在蛋白簇的表面或者空隙部分，而是呈鏈狀將蛋白簇和菌體連接起來(lái)。這可能是因?yàn)榘舛嗵钱a(chǎn)生在蛋白膠粒聚合之后，被限制在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙內(nèi)。這種空間限制阻礙了胞外多糖和蛋白之間的作用。

1999年，Tuinier，R.和Kees G.de Kruif等人對(duì)EPS(由Lactococcus lactis subsp.cremoris strain NIZO B40產(chǎn)生)和牛乳中的成分酪蛋白，乳清蛋白等作用做了詳細(xì)系統(tǒng)的研究[13，14]。

當(dāng)混合的多糖和蛋白質(zhì)之間發(fā)生結(jié)合作用時(shí)，體系也會(huì)變得不穩(wěn)定，在這種情況下，多糖吸附到蛋白質(zhì)的表面，如果其不夠大而不能完全覆蓋一個(gè)蛋白質(zhì)，那么一個(gè)多糖就會(huì)吸附到不止一個(gè)蛋白質(zhì)表面，從而把兩個(gè)或者更多的蛋白質(zhì)顆粒橋連起來(lái)。由未吸附的多糖所導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的吸引最終也會(huì)導(dǎo)致相分離[15]。

低黏度的發(fā)酵劑產(chǎn)胞外多糖能力較弱，與蛋白質(zhì)結(jié)合較少。高黏度發(fā)酵劑由于產(chǎn)胞外多糖較多，與蛋白結(jié)合后形成了較大的顆粒，顆粒半徑的增大對(duì)沉降速度的增進(jìn)作用與黏度升高對(duì)沉降速度的降低作用相比，前者是指數(shù)級(jí)效果。因此，高黏度發(fā)酵劑更容易分層沉淀。

4 結(jié)論

發(fā)酵乳凝膠黏度對(duì)乳酸菌飲料蛋白質(zhì)穩(wěn)定性有明顯影響。黏度越大，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越差，沉淀率越高。黏度從低到高的變化過(guò)程中，沉淀率的變化速率先大后小，顯示低黏度區(qū)間影響明顯。這是影響蛋白質(zhì)酸性條件下穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素，對(duì)酸性乳飲料的生產(chǎn)技術(shù)有指導(dǎo)意義。研究表明黏度較低的發(fā)酵乳制備乳酸菌飲料穩(wěn)定性較好。利用黏度為51.4 mPa's的低黏度發(fā)酵乳，加入0.4%的大豆多糖作為穩(wěn)定劑，用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行生產(chǎn)技術(shù)驗(yàn)證，一級(jí)壓力：30 mpa，二級(jí)壓力：15 mpa，此時(shí)得到的乳酸菌飲料穩(wěn)定性最好，沉淀率為0.26%，優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)水平。