梁浩明，張文芳，吳志權，徐彤彤，胡梅，林碧珊

(國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

防己Stephaniae Tetrandrae Radix為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore的干燥根，具有祛風止痛、利水消腫之功，主要用于風濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒[1]。防己的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)是江西省，由于野生資源破壞、分布區(qū)域縮小、年產(chǎn)量遞減、人工種植質(zhì)量不穩(wěn)定及品種混雜等不利因素，嚴重制約著該地區(qū)藥材的臨床應用[2-4]。

目前，中藥主要以水作為轉(zhuǎn)化媒介應用至臨床和生產(chǎn)。水溶性的雙芐基異喹啉類成分-粉防己堿和防己諾林堿是防己的專屬性和藥效成分[5-6]，是2015年版《中國藥典》含量測定的指標成分。但經(jīng)水煎煮后防己的極性成分種類繁多、藥理活性各異，僅以2種生物堿為指標難以反映該藥材質(zhì)量和臨床療效。本文擬采用UPLC法，通過收集江西省5市15個產(chǎn)地防己藥材，以飲片水煎煮提取物為研究對象，建立了江西產(chǎn)地防己水提物的UPLC指紋圖譜，并采用相似度分析、系統(tǒng)聚類分析和主成分分析對其質(zhì)量進行評價，為防己藥材的種質(zhì)、藥材來源及內(nèi)在質(zhì)量評價基礎提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC液相系統(tǒng)，Waters公司(二元高壓泵，柱溫箱，自動進樣器和二極管陣列檢測器)； CORTECS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，Waters公司； MS105DU型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水制備儀(MILLIPORE公司)。

防己諾林堿對照品(批號110793-201606，質(zhì)量分數(shù)98.8%)、粉防己堿對照品(批號110711-201609，質(zhì)量分數(shù)99.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院；木蘭花堿對照品(批號150813，質(zhì)量分數(shù)≥98%，成都普菲德生物技術有限公司)；無水乙醇為分析純；乙腈和磷酸均為色譜純；超純水由MILLIPORE純水儀制備。15批防己藥材分別于2016年8月—2018年3月收集于江西不同種植產(chǎn)地，詳細信息見表1，經(jīng)本單位黃國滿鑒定均為防己Stephaniae Tetrandrae Radix，按2015年版《中國藥典》一部炮制項要求制成飲片。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-質(zhì)量分數(shù)0.5%H3PO4水溶液(B)，洗脫梯度(0～3 min，0%A；3～5 min，0%→15%A；5～25 min，15%→30%A；25～29 min，30%→80%A)；流速：0.2 mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：0.2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 按2015年版《中國藥典》炮制要求[1]，除去雜質(zhì)，稍浸，洗凈，潤透，切厚片，干燥制得防己飲片。取防己飲片加水煎煮2次，合并煎煮液，減壓濃縮，冷凍干燥制得凍干粉，備用。取相當于飲片0.5 g的防己凍干粉，精密稱定，置20 mL量瓶中，加入30%(體積分數(shù)，下同)乙醇適量使溶解，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)10 min，取出，放冷，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

表1 15個不同產(chǎn)地防己樣品信息

Table1Information of Stephaniae Tetrandrae Radix from fifteen origins

編號產(chǎn)地/類型收集時間S1江西省吉安泰和縣2016-08S2江西省宜春市樟樹縣2017-11S3江西省撫州市金溪縣2017-10S4江西省撫州市南豐縣2017-08S5江西省宜春市高安市2017-11S6江西省景德鎮(zhèn)市2017-11S7江西省吉安市泰和縣2016-08S8江西省景德鎮(zhèn)市2017-11S9江西省景德鎮(zhèn)市2017-09S10江西省吉安市遂川縣2017-10S11江西省吉安市遂川縣2017-10S12江西省吉安市遂川縣2017-11S13江西省景德鎮(zhèn)市2018-03S14江西省上饒市鄱陽縣2018-03S15江西省上饒市鄱陽縣2018-03

2.2.2 對照品溶液的制備 取防己諾林堿、粉防己堿、木蘭花堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為19.9、300.6、141 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取防己水提物樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液各1份，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以11號峰(粉防己堿)為參照峰，測得11個共有峰的相對保留時間的RSD值均小于0.3%，相對峰面積的RSD值均小于2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取防己水提物樣品共6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液各6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以11號峰(粉防己堿)為參照峰，測得11個共有峰的相對保留時間的RSD值均小于0.4%，相對峰面積的RSD值均小于4.0%，表明方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取防己水提物樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液各1份，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進樣測定，以11號峰(粉防己堿)為參照峰，測得11個共有峰的相對保留時間的RSD值均小于0.6%，相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相似度評價

對表1中15個產(chǎn)地的防己水提取物，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，通過比對確定15個防己水提物指紋圖譜，見圖1。其中，出峰時間基本一致、峰面積相對較大且分離度符合要求的11個色譜峰設為共有特征色譜峰，通過對比對照品與樣品指紋圖譜中的色譜峰，確定樣品特征色譜圖中7號峰為木蘭花堿，10號峰為防己諾林堿，11號峰為粉防己堿，結(jié)果見圖2。

1110987654321420400380360340320300280260240220200180160140120100806040200RS15S14S13S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S10246810121416182022242628t/minU/mV

圖115個產(chǎn)地防己水提物和參比(R)UPLC指紋圖譜

Figure1UPLC fingerprints of 15 batches of Stephaniae Tetrandrae Radix aqueous extracts and their reference fingerprint

7.木蘭花堿； 10.防己諾林堿； 11.粉防己堿。

圖2混合對照品溶液(A)和防己水提物供試品溶液(B)的UPLC色譜圖

Figure2UPLC chromatograms of mixed reference solution(A)and Stephaniae Tetrandrae Radix sample solution (B)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012 版)對15個防己水提物樣品UPLC指紋圖譜建立共有模式，作為對照指紋圖譜，各批次樣品與其比較，進行相似度評價，結(jié)果見表2。根據(jù)相似度大小，來源于江西省東北部景德鎮(zhèn)市和上饒市的6批樣品相似度大于0.985，歸為I類 ，其余地區(qū)批次歸為Ⅱ類。

2.5 系統(tǒng)聚類分析

以11個共有特征峰為變量，采用SPSS19.0軟件，選擇離差平方和法(Ward’s method)為聚類方法、歐氏距離平方法(Squared Euclidean Distance)為測量距離方法進行聚類分析，聚類結(jié)果見圖3。可見，15個產(chǎn)地防己樣品被分為兩大類，Ⅰ類包括S6、S8、S9、S13、S14、S15，均來源于景德鎮(zhèn)和上饒市；Ⅱ類包括其余批次樣品，來源于吉安市、宜春市和撫州市，分類結(jié)果與相似度評價結(jié)果一致，可區(qū)分不同產(chǎn)地防己的來源。

表2 江西15個不同產(chǎn)地防己樣品相似度評價結(jié)果

Table2Similarity results of Stephaniae Tetrandrae Radix samples from 15 origins in Jiangxi province

編號相似度分類編號相似度分類S10.971ⅡS90.992ⅠS20.962ⅡS100.952ⅡS30.982ⅡS110.977ⅡS40.965ⅡS120.956ⅡS50.978ⅡS130.985ⅠS60.995ⅠS140.991ⅠS70.960ⅡS150.990ⅠS80.996Ⅰ

2.6 主成分分析

以防己水提物11個共有峰峰面積為變量，運用SPSS19.0軟件，選擇特征值和貢獻率為依據(jù)進行主成分提取，以根據(jù)載荷量計算綜合得分，見表3。主成分個數(shù)的提取原則為其對應的特征值大于1，故取前4個作為主成分，其累積貢獻率達到87.696%，基本可說明各指標的所有信息。特征向量表可知，主成分1主要反映4號、8號、9號和10號(防己諾林堿)色譜峰，主成分2反映5號、6號、7號(木蘭花堿)色譜峰，主成分3反映1號和2號色譜峰，主成分4則反映3號和11號(粉防己堿)色譜峰。綜合得分排序結(jié)果見表4?？梢姡瑏碓从诰暗骆?zhèn)市和上饒市的S6、S8、S9、S13、S14、S15共6批防己的綜合得分較高，結(jié)合相似度與聚類分析結(jié)果，推斷上述2個地區(qū)的防己質(zhì)量較優(yōu)。

S13S15S14S8S9S6S1S2S3S7S10S5S11S12S41015202505Ⅰ類Ⅱ類

圖315個產(chǎn)地防己水提物聚類分析樹狀圖

Figure3Cluster analysis tree of Stephaniae Tetrandrae Radix samples from 15 origins

表3 主成分特征值及貢獻率結(jié)果

Table3Eigenvalue and contribution rate of principal component analysis

主成分特征值貢獻率/%累計貢獻率/%14.32839.34739.34722.11919.26558.61331.75115.91974.53241.44813.16487.696

表4 綜合得分排序Table 4 Scores of principal component analysis

3 討論

2015年版《中國藥典》收錄的防己含量測定指標成分是粉防己堿和防己諾林堿，本文采用UPLC法建立防己水提物指紋圖譜，在法定標準基礎上進一步提升江西產(chǎn)區(qū)防己藥材的質(zhì)量控制手段。本研究結(jié)果顯示，15個不同產(chǎn)地防己水提物指紋圖譜的相似度較高，均大于0.95，說明主產(chǎn)區(qū)內(nèi)不同產(chǎn)地間的化學組成較一致，可以作為防己藥材來源。聚類分析既適用于藥材產(chǎn)地區(qū)分，也用于不同等級、規(guī)格的鑒別；主成分分析則將多指標凝聚成較強的信息作為綜合評價指標[7]。本文的主成分分析結(jié)果顯示，4個主成分累計方差貢獻率為87.696%，粉防己堿和防己諾林堿則分布于2個不同主成分內(nèi)，表明《中國藥典》含量測定項下采用的2種成分貢獻率有限，而采用指紋圖譜更有利于防己的整體質(zhì)量控制；結(jié)合相似度評價和聚類分析顯示，景德鎮(zhèn)市和上饒市防己藥材成分組成和含量一致，綜合評價得分高，表明江西東北部此2個產(chǎn)地的藥材質(zhì)量更優(yōu)，可區(qū)分于其他產(chǎn)地藥材，為該產(chǎn)區(qū)防己的種質(zhì)、藥材來源以及相關制品的質(zhì)量穩(wěn)定性提供參考依據(jù)。

近年來，有研究報道通過比較防己水提物及其活性單體的毒效關系，發(fā)現(xiàn)防己水提物的鎮(zhèn)痛效果更優(yōu)，粉防己堿作為防己的主要組分并不能夠完全表征防己的藥效；防己水提物停藥后的肝臟毒性可逆性是粉防己堿停藥后所不具備的，提示其水溶性強、極性大的生物堿類成分起了協(xié)同和持續(xù)的作用[8-9]。因此，本文通過江西產(chǎn)區(qū)防己UPLC指紋圖譜的建立與分析，為進一步研究防己有效物質(zhì)成分奠定了基礎。