李博維，周萬興，趙艷群，周玉良，崔晨霞

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

MMP-2、-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族的其中一員，多數(shù)分布于心肌組織中[1]，既往大量研究發(fā)現(xiàn)多種心血管疾病導致的心室重構(gòu)過程與MMP-2、-9及其內(nèi)源性抑制劑——金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)的水平和比值有較密切的關(guān)系，且通過改變上述蛋白水平或比值可有效改善心室重構(gòu)[2-4]。然而由于心肌組織難以獲取，研究者在臨床試驗中多通過測定患者血清相關(guān)蛋白水平進行研究。但目前尚無研究證實血清與心肌組織MMP-2、-9、TIMP-1水平具有相關(guān)性。因此本實驗就這一問題進行探討，嘗試為臨床評估心室重構(gòu)的新手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

HP5500心臟彩色多普勒超聲儀(飛利浦公司)；渦旋振蕩器(江蘇QL-901)；-20 ℃冰箱(德國Siemens公司)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)；低速冷凍離心機(德國Sigma公司)；臺式高速冷凍離心機(德國Heracus公司)；Elx500酶標儀(美國Biotek公司)；UVS-99紫外分光光度計(ACTGENE)；Elx500酶標儀(美國Biotek公司)。

1.2 主要藥品及試劑

人重組CD147蛋白(美國R&D公司)；多西環(huán)素粉劑(Sigma公司)；大鼠MMP-2ELISA試劑盒(美國Abnova公司)；大鼠TIMP-1ELISA試劑盒、大鼠CD147 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；Anti-MMP-2 抗體(美國Abgent公司)；Anti-TIMP-1抗體(美國R&D公司)；Anti-CD147抗體(英國Abcam公司)。

1.3 實驗動物

10只8周齡SPF級WKY雄性大鼠，30只8周齡SPF級原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)雄性大鼠均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：11400700025288。

1.4 實驗設計及取材

實驗取材來源于本研究組的前期實驗[5-6]，將大鼠分組如下：20只8周齡雄SHR隨機分為2組，每組10只。其中一組接受人重組CD147蛋白(MMPs誘導劑)尾靜脈注射，另一組除接受CD147注射外，加用多西環(huán)素粉劑(DOX、MMPs活性抑制劑)溶于生理鹽水后灌胃，本實驗將上述兩組歸為干預組。另有10只8周齡SHR與10只8周齡WKY大鼠均接受等劑量生理鹽水尾靜脈注射及灌胃，本實驗將這兩組歸為非干預組。飼養(yǎng)56 d后(16周齡)統(tǒng)一稱質(zhì)量，用10%(φ)水合氯醛(0.3～0.4 mL/100 g體質(zhì)量)經(jīng)腹腔注射進行全身麻醉，胸部備皮后取仰臥位固定并開腹解剖，鈍性分離出下腔靜脈后，用5 mL注射器在腎水平處穿刺血管采血3～5 mL，用于檢驗各蛋白水平，采血后迅速打開胸腔切除心臟，并分離左室，用生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干組織水分，并保存在-80 ℃冰箱備用。

1.5 心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的檢測

將-80 ℃保存的心肌組織用玻璃研磨器置于冰上研磨，并用全細胞裂解液(含PMSF)進行裂解30 min后，12 000 r/min，4 ℃臺式高速冷凍離心機離心30 min。取上清液用Western blot方法進行測定[5]。

1.6 血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的檢測

抽取大鼠血液后自然凝固10～20 min，3 000 r/min低速冷凍離心機離心10 min，吸取上清液置于-20 ℃冰箱保存，用ELISA方法進行測定[7]。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標準差表示。組間比較方差齊時用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；方差不齊時用非參數(shù)檢驗。兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值

干預組及非干預組大鼠血清、左室心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值見圖1。兩組之間心肌組織各蛋白水平及變化趨勢可詳見本研究組的前期實驗[5-6]。兩組間心肌組織中MMP-2/TIMP-1比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與非干預組相比，干預組心肌組織中MMP-9/TIMP-1比值明顯減少(P<0.05)。而在血清中，兩組間MMP-2、MMP-9水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，干預組TIMP-1水平較非干預組有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。另外，兩組間血清MMP-2/TIMP-1比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但干預組血清MMP-9/TIMP-1比值較非干預組增加(P<0.05)。

無論是在干預組還是在非干預組中，心肌組織MMP-2/TIMP-1比值均比血清中相關(guān)比值高(P<0.05)。在非干預組中心肌組織MMP-9/TIMP-1比值較血清中相關(guān)比值高，而在干預組中恰好相反，血清MMP-9/TIMP-1比值高于心肌組織中相關(guān)比值，兩項結(jié)果差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

血清與心肌各蛋白及相關(guān)比值水平3002001000非干預組干預組△#*△△△血清MMP-2(ng/mL)心肌組織MMP-2血清MMP-9(ng/mL)心肌組織MMP-9血清TIMP-9(ng/mL)心肌組織TIMP-1血清MMP-2/TIMP-1(%)心肌組織MMP-2/TIMP-1(%)血清MMP-9/TIMP-1(%)心肌組織MMP-9/TIMP-1(%)

與非干預組心肌組織比較：*P<0.05；與非干預組血清比較：#P<0.05；與同組血清比較：△P<0.05。

圖1大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值

Figure1Levels and ratios of MMP-2,MMP-9 and TIMP-1 in serum and left ventricular myocardial tissue of rats

2.2 兩組大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值的相關(guān)性

干預組大鼠血清與左室心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)，MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值也無明顯相關(guān)性(P>0.05)。非干預組大鼠血清與心肌中MMP-2、MMP-9蛋白水平也無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但TIMP-1呈正相關(guān)(P<0.05，r=0.521，圖2)，且MMP-2/TIMP-1呈明顯正相關(guān)(P<0.001，r=0.758，圖3)，但MMP-9/TIMP-1比值無明顯相關(guān)性。

兩組數(shù)據(jù)綜合分析，血清與左室心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白水平均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，血清及心肌組織中的MMP-2/TIMP-1比值呈顯著正相關(guān)(P<0.001，r=0.568，圖4)，MMP-9/TIMP-1比值無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

10080604020血清TIMP-1P<0.05,r=0.5210.000.100.200.300.400.500.60心肌組織TIMP-1

圖2非干預組大鼠血清與心肌組織TIMP-1的相關(guān)性

Figure2Correlation of TIMP-1 between serum and myocardial tissue in the non-intervention group

0.001.002.003.004.005.00心肌組織MMP-2/TIM-12.502.001.501.000.500.00血清MMP-2/TIMP-1P<0.001,r=0.758

圖3非干預組大鼠血清與心肌組織MMP-2/TIMP-1的相關(guān)性

Figure3Correlation of MMP-2/TIMP-1 between serum and myocardial tissue in the non-intervention group

P<0.001,r=0.5860.01.02.03.04.05.0心肌組織MMP-2/TIMP-12.502.001.501.000.500.00血清MMP-2/TIMP-1

圖4綜合兩組血清與心肌組織MMP-2/TIMP-1的相關(guān)性

Figure4Correlation of MMP-2/TIMP-1 between serum and myocardial tissue in both groups

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠血清中MMP-2、MMP-9水平經(jīng)CD147誘導后變化趨勢并不如心肌組織中相關(guān)蛋白明顯[5-6]，且與左室心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白水平無明顯相關(guān)性，可能與以下因素有關(guān)：本實驗中干預組大鼠均接受CD147藥物干預，部分同時接受DOX干預[5-6]。其中DOX是MMPs的廣譜拮抗劑，主要抑制MMPs活性，一般不影響其蛋白水平[8]。但CD147作為MMPs的天然誘導物，對體內(nèi)多種MMPs(如：MMP-2、-8、9、-14、MT1-MMP等)的蛋白水平及基因表達均有上調(diào)作用[9]。同時MMP-8、-14、MT1-MMP也會影響MMP-2、-9蛋白水平[1，9]。此外，CD147還對多種炎性因子(如：白介素18、環(huán)孢素A等)起上調(diào)作用，這些炎性因子也可以進一步影響MMP-2、-9蛋白水平[9]。上述結(jié)果提示，要想真實反映血清與左室心肌組織中MMPs的相關(guān)性，首先須排除外界干擾因素。但是，在剔除CD147的干預因素后，非干預組大鼠血清與左室心肌組織MMP-2、-9相關(guān)性仍不明顯。這可能由于MMP-2、-9除分布于心肌組織外，還可見于成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、骨骼肌及多種腫瘤細胞中，既往研究發(fā)現(xiàn)這些細胞中的MMP-2、-9也有一定影響作用[10]?？梢姡逯械腗MP-2、-9蛋白水平是機體多部位、多因素綜合反應的體現(xiàn)，未必能單獨反映心肌組織相應蛋白的水平。

本實驗還發(fā)現(xiàn)大鼠血清與左室心肌組織中MMP-2/TIMP-1比值有良好的相關(guān)性，且當剔除CD147以及DOX的干擾因素后，兩者之間MMP-2/TIMP-1比值的相關(guān)性更為明顯。TIMP-1作為MMPs的特異性抑制劑，可以在等分子量下1∶1非共價結(jié)合MMPs的催化區(qū)域，阻止MMPs與底物結(jié)合而調(diào)節(jié)MMPs活性[10]，在多種疾病狀態(tài)下，不同的病變部位中，MMP-2、TIMP-1之間均可相互影響[11-12]。有研究認為心室重構(gòu)的發(fā)生是由于MMPs、TIMPs失衡所致。既往也有臨床研究發(fā)現(xiàn)血清中的MMPs/TIMPs比值與心室重構(gòu)指標相關(guān)[13-15]。而MMP-2/TIMP-1比值正是其中一類重要的衡量指標，且本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠血清與左室心肌中兩者比值具有良好相關(guān)性，這可能是由于MMP-2、TIMP-1蛋白雖然在全身多組織中分布并相互作用，但兩者的變化趨勢仍與心肌組織中的相似。但本實驗發(fā)現(xiàn)無論在干預組還是非干預組中，血清與左室心肌組織的MMP-9/TIMP-1含量均無明顯相關(guān)性。過去也有一些實驗發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。如Garcia等[7]發(fā)現(xiàn)不同血壓的患者血清中，MMP-2及MMP-9水平及活性的變化趨勢并不一致：隨著血壓增高，血清MMP-9水平的增幅更大，但心肌組織MMP-9水平是否存在同樣趨勢尚未可知。而血清與心肌MMP-9水平增幅不匹配，可能是本實驗中血清與心肌MMP-9/TIMP-1相關(guān)性不明顯的原因之一。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠血清與心肌組織中MMP-2/TIMP-1比值有較好的相關(guān)性。由于心肌組織難以在臨床實驗中獲取，本研究結(jié)果提示血清中MMP-2/TIMP-1比值可能可以代替心肌組織中的相關(guān)蛋白，成為評估患者心室重構(gòu)的指標。血清蛋白與心肌組織蛋白水平的相關(guān)性還需進一步研究。