孫凱廷　蔡美　曾梅艷

〔摘要〕 目的 通過對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的分析以及肺癌細(xì)胞TGF-β、VEGF的表達(dá)情況，從分子水平上觀察益肺飲和CIK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用時對肺癌細(xì)胞免疫逃逸的影響。方法 將肺癌細(xì)胞分為6組進(jìn)行干預(yù)，A：10% FBS組、B：無藥血清組、C：CIK+無藥血清組、D：益肺飲組、E：CIK組、F：益肺飲+CIK組。采用CCK-8法、流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞的增殖、凋亡情況，運(yùn)用ELISA法檢測A549細(xì)胞TGF-β、VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果 （1）與A、B組比較，益肺飲和CIK單用或聯(lián)用時有明顯的增殖抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用（P<0.05）;E組與F組比較，肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡情況無明顯差異（P>0.05）。（2）相比于A、B組，D、E、F組對TGF-β、VEGF的分泌均有抑制作用（P<0.05）。與D、E組比較，F(xiàn)組對TGF-β的抑制效果最明顯（P<0.05），但VEGF的表達(dá)情況無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 益肺飲與CIK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)對肺癌細(xì)胞TGF-β的抑制效果，但對VEGF的抑制效果無明顯增強(qiáng)作用;不能增強(qiáng)對A549細(xì)胞增值抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 益肺飲;肺癌;CIK;細(xì)胞凋亡;免疫逃逸

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.007

Study on Intervention of Yifei Decoction Combined with CIK Cells in Immune

Escape of Lung Cancer A549 Cells

SUN Kaiting1， CAI Mei2*， ZENG Meiyan1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan

Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Yifei Decoction combined with CIK cells in immune escape of lung cancer cells at molecular level， through analysis of proliferation and apoptosis of lung cancer cells and expressions of transforming growth factor-β （TGF-β） and VEGF in the lung cancer cells. Methods The lung cancer cells were divided into 6 groups for intervention. A： 10% FBS group， B： drug-free serum group， C： CIK + drug-free serum group， D： Yifei Decoction group， E： CIK group， and F： Yifei Decoction + CIK group. The proliferation and apoptosis of A549 cells were detected by CCK-8 method and flow cytometry. ELISA was used to detect the expressions of TGF-β and VEGF in A549 cells. Results （1） Compared with the group A and the group B， single use of Yifei Decoction or CIK， or their combination showed significant effects of inhibition on proliferation and induction of apoptosis （P<0.05）. There was no significant difference in proliferation and apoptosis of lung cancer cells between the group E and the group F （P>0.05）. （2） Compared with the groups A and B， there was an effect of inhibition on the secretion of TGF-β and VEGF in the groups D， E and F （P<0.05）. Compared with the groups D and E， there was the most obvious inhibitory effect on TGF-β in the group F （P<0.05）， but there was no significant difference in the expression of VEGF （P>0.05）. Conclusion Yifei Decoction can enhance the inhibitory effect on TGF-β in lung cancer cells when combined with CIK cells， but it has no obvious enhancement effect on the inhibition of VEGF. And it can not enhance the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in A549 cells.

〔Keywords〕 Yifei Decoction; lung cancer; CIK; cell apoptosis; immune escape

由于腫瘤免疫逃逸機(jī)制的存在，腫瘤細(xì)胞可以通過一系列手段避開免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷，從而使腫瘤發(fā)生進(jìn)展、轉(zhuǎn)移?；诖耍S著對腫瘤免疫機(jī)制的研究逐漸深入，腫瘤的免疫治療成為了當(dāng)今研究的一大熱點(diǎn)，越來越多的免疫治療策略面世，為腫瘤患者帶來了新的福音，如過繼免疫治療、肺癌疫苗、免疫檢查點(diǎn)抑制等[1]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷（cytokine induced killer， CIK）細(xì)胞是將游離人體的外周血單個核細(xì)胞加入多種細(xì)胞因子后培養(yǎng)一段時間后獲得的細(xì)胞。CIK具有抗腫瘤活性強(qiáng)，殺瘤譜廣，且具有很強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力等特點(diǎn)，作為過繼免疫治療的代表，具有明確的抗腫瘤效應(yīng)[2]。

腫瘤的免疫逃逸機(jī)制非常復(fù)雜，而其分泌相關(guān)的免疫抑制因子是其中重要的機(jī)制之一，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）[3]、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth，VEGF）[4]等，能夠改變腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤免疫反應(yīng)。作為腫瘤免疫逃逸的頭號主導(dǎo)者，大量實(shí)驗(yàn)證明TGF-β通過多條途徑來發(fā)揮免疫抑制作用，如抑制免疫細(xì)胞的增殖和活化、調(diào)節(jié)細(xì)胞表型、抑制淋巴細(xì)胞分化、促進(jìn)Treg細(xì)胞（一類能發(fā)揮重要腫瘤免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）的產(chǎn)生等[5-6]。VEGF能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活，導(dǎo)致新血管的形成，除此之外，VEGF能夠通過多種途徑發(fā)揮免疫抑制的作用，包括促進(jìn)抑制性免疫細(xì)胞亞群的擴(kuò)增[7]。同時針對VEGF的免疫抑制劑也一直是研究的熱點(diǎn)，聯(lián)合VEGF免疫抑制劑的抗腫瘤治療有望在未來成為新的治療策略[8]。

諸多研究表明，中醫(yī)藥可以下調(diào)TGF-β、VEGF等免疫抑制因子的表達(dá)[9]。因此，以提高患者生存質(zhì)量，改善患者癥狀，調(diào)節(jié)患者免疫功能的生物免疫聯(lián)合中醫(yī)藥治療模式可能成為肺癌治療的趨勢。

中藥復(fù)方益肺飲臨床用于治療老年肺癌有一定的療效，我們前期的實(shí)驗(yàn)研究表明益肺飲具有良好的抑制肺癌細(xì)胞增殖誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究通過益肺飲含藥血清聯(lián)合CIK細(xì)胞，觀察對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡以及免疫逃逸相關(guān)因子VEGF、TGF-β的影響，以進(jìn)一步探索益肺飲的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動物

20只SD大鼠，雄性，體質(zhì)量為（200±20）g，SPF級，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2? 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人肺癌細(xì)胞A549，由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供。外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）：CIK細(xì)胞的前體細(xì)胞，由健康志愿者獲得知情同意后捐獻(xiàn)。

1.3? 實(shí)驗(yàn)藥材

益肺飲：黃芪15 g，臭牡丹15 g，黨參15 g，茯苓10 g，土鱉蟲5 g，白術(shù)10 g，土貝母5 g，陳皮10 g，淫羊藿10 g，法半夏10 g，白花蛇舌草15 g，補(bǔ)骨脂10 g，瓜蔞殼10 g，半枝蓮15 g，甘草5 g。以上飲片采購于湖南省中醫(yī)藥研究院名醫(yī)堂中藥房，由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥師彭偉鑒定。

1.4? 主要試劑與儀器

PRMI 1640培養(yǎng)基、FBS 胎牛血清、L-Glutamine、200 mmol/L Solution均購自美國 Gibco 公司;Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（美國GE Healthcare Bioscience公司）;人IFN-γ、IL-1α、IL-2均購自美國Peprotech公司;抗CD3單克隆抗體Anti-Human CD3（eBioscience公司）;Annexin V FITC/PI Kit、Anti-Human CD56， APC、Anti-Human CD8，PE、Anti-Human CD3， FITC均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;CCK-8試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司）。流式細(xì)胞儀（BDFACSJazz碧迪醫(yī)療器械有限公司）;酶標(biāo)儀（MK3上海賽默生物科技發(fā)展有限公司）。

1.5? 主要試劑配制

CIK培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基，加1 000 U/mL的IL-2，1%的L-谷氨酰胺，10%的FBS。

1.6? 方法

通過前期的濃度篩選，益肺飲含藥血清濃度在15%時，對肺癌A549細(xì)胞的增殖、凋亡都有較好的作用。故本實(shí)驗(yàn)取15%濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6.1? 含藥血清制備? 將益肺飲藥物煎煮好后，減壓濃縮（減壓薄膜濃縮法：濃縮溫度80 ℃，濃縮轉(zhuǎn)速30 r/min），濃縮至432 mL，濃度約為2.22 g/mL，密封后4 ℃保存?zhèn)溆?。將大?0只，分為2組，每組10只，設(shè)實(shí)驗(yàn)組予益肺飲灌胃，對照組予等量生理鹽水灌胃。益肺飲方，按人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算，200 g大鼠等效量為160/60×6.25×4=66.7（g/kg），大鼠灌胃體積按1.5 mL/100 g，每日2次，連續(xù)3 d，第4天1次服用全天劑量，灌胃2 h后，麻醉解剖，腹主動脈采血，離心分離血清，獲得實(shí)驗(yàn)組血清（含藥血清）及對照組血清（無藥血清），標(biāo)記后，-40 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2? CIK細(xì)胞培養(yǎng)? 收集健康志愿者外周血，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法[10]分離PBMC，取15 mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液加入至50 mL離心管中，加入1∶1鹽水稀釋的30 mL血液稀釋液沿管壁緩慢加至Ficoll淋巴細(xì)胞分離液面上;離心;可見離心管中出現(xiàn)明顯的分層，從上到下依次為稀釋的血漿混合液層、單核細(xì)胞層、分離液層、紅細(xì)胞層。小心吸取單核細(xì)胞層，置于新的離心管中，加入適量的生理鹽水。再次離心;重復(fù)上述步驟離心洗滌2次，獲得細(xì)胞。

將獲得的PBMC用1 640培養(yǎng)基（含10% FBS）按照1×106個/mL密度種入T25培養(yǎng)瓶后，加入1%

L-谷氨酰胺，3 000 U/mL的IFN-γ，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)24 h后，加入1 000 U/mL的IL-2，2 000 U/mL的IL-1α，300 ng/mL的CD3單克隆抗體;每天觀察細(xì)胞并計數(shù)，通過補(bǔ)充含1 000 U/mL IL-2，1%的L-谷氨酰胺，10%的FBS的CIK培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度不超過2×106個/mL。約2周后即可收獲CIK細(xì)胞。

1.6.3? CCK-8法檢測益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞對A549細(xì)胞增殖影響? 共設(shè)置6個分組，A：10%FBS組（10%FBS）、B：無藥血清組（10%無藥血清）、C：CIK+無藥血清組（CIK+10%無藥血清）、D：益肺飲組（15%含藥血清）、E：CIK組、F：益肺飲+CIK組（15%含藥血清+CIK）

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計，取生長良好的肺癌A549細(xì)胞計數(shù)，將A549細(xì)胞以3 000個/孔種入96孔板，CIK細(xì)胞以20∶1的效靶比鋪板，每組設(shè)置4個復(fù)孔。12 h后，根據(jù)分組進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)24 h后，吸棄孔板中原液，加入新鮮培養(yǎng)基，再加入CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處各孔的吸光度。抑制率按以下公式計算：

抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值均數(shù)/10%FBS組OD值均數(shù)）×100%

1.6.4? 流式細(xì)胞儀檢測益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞對A549細(xì)胞凋亡影響? 分組同前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計，取生長良好的肺癌A549細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)，其中CIK細(xì)胞效靶比為20∶1。24 h后收集細(xì)胞，離心洗滌細(xì)胞2～3次。根據(jù)Annexin V FITC/PI Kit說明書，每管取500 μL流式緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V FITC/10 μL PI，室溫避光孵育5 min后上機(jī)檢測。

1.6.5? ELISA法檢測A549細(xì)胞免疫逃逸相關(guān)因子TGF-β1、VEGF? 取生長良好的A549細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，分別進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)24 h后，吸取細(xì)胞上清液，加入至離心管中，800 g，5 min，離心后吸取上清，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)ELISA試劑盒所示步驟（雙抗夾心法），分別檢測TGF-β、VEGF的OD值，各組每個指標(biāo)設(shè)3個復(fù)孔，取平均OD值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

1.7? 統(tǒng)計方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布及組間方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，若不符合方差齊性，采用Wilconxon秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平采用a=0.05。

2 結(jié)果

2.1? CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性

通過CCK-8實(shí)驗(yàn)，各組對A549細(xì)胞的抑制率見表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，益肺飲和CIK細(xì)胞單用及聯(lián)用其抑制率與A組、B組相比有明顯差異（P<0.05）。E組增殖抑制最明顯，平均抑制率可達(dá)75.07%，C、E、F組之間比較抑制率無明顯差異，但均優(yōu)于D組（P<0.05）。

2.2? 流式細(xì)胞儀檢測益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞對A549細(xì)胞凋亡影響

通過流式檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見表2、圖1）：D組的凋亡率可達(dá)（17.20±1.72）%，E組的凋亡率可達(dá)（25.13±3.00）%，F(xiàn)組凋亡率可達(dá)（26.57±3.04）%，均明顯優(yōu)于A、B組（P<0.05）。C、E、F組促凋亡作用明顯優(yōu)于D組（P<0.05），但是3組兩兩比較無明顯差異（P>0.05）。

2.3? ELISA法檢測免疫逃逸相關(guān)因子TGF-β1、VEGF

ELISA法檢測結(jié)果表明（見表3），與A組和B組相比，D組和E組對TGF-β、VEGF的分泌均有一定的抑制作用（P<0.05），但D、E兩組比較無明顯差異（P>0.05）。各組間兩兩比較，F(xiàn)組對TGF-β的抑制效果最明顯（P<0.05），F(xiàn)組VEGF濃度最低290.17 pg/mL，但與D、E組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

正常機(jī)體的免疫系統(tǒng)可識別惡變的腫瘤細(xì)胞，并通過特異性免疫應(yīng)答來清除腫瘤細(xì)胞。然而，因?yàn)槊庖咛右輽C(jī)制的存在，使得機(jī)體免疫系統(tǒng)無法有效及時地清除異變細(xì)胞。腫瘤免疫逃逸的機(jī)制是如今研究的熱點(diǎn)，這有助于進(jìn)一步尋找有效的藥物靶點(diǎn)。

李宏良等[11]的研究顯示天冬、薏苡仁、北沙參等中藥有助于提高CIK細(xì)胞活性，促進(jìn)其增殖，為CIK聯(lián)合中藥治療方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。孟祥林等[12]的研究顯示中醫(yī)扶正固本法結(jié)合CIK細(xì)胞過繼免疫在改善患者CEA、AFP、CA125腫瘤標(biāo)志物以及CD3、CD4免疫功能方面能更好地降低患者腫瘤標(biāo)志物水平，改善患者的免疫功能。鄭心等[13]研究報告了肺抑瘤膏聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞可降低血清VEGF水平。由此可見中醫(yī)藥聯(lián)合CIK治療惡性腫瘤不失為一種新的治療方向和思路。

基于此，通過益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞對肺癌細(xì)胞免疫逃逸干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究，以期在細(xì)胞及分子水平上研究益肺飲含藥血清聯(lián)合CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。通過CCK-8、流式細(xì)胞檢測，我們發(fā)現(xiàn)益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞時對A549細(xì)胞的增殖抑制及促凋亡并沒有明顯的協(xié)同作用，考慮原因可能是含藥血清對CIK細(xì)胞活性有影響。通過ELISA法檢測經(jīng)藥物干預(yù)后的A549細(xì)胞上清液，結(jié)果表明，益肺飲含藥血清能夠有效地降低A549細(xì)胞分泌TGF-β1、VEGF的濃度。益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞組對TGF-β濃度抑制顯得更為有效，但益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞并不能對VEGF產(chǎn)生更為有效的抑制效果。TGF-β的分泌可因不同的刺激誘導(dǎo)，包括類固醇、維甲酸、表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF），神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）、淋巴細(xì)胞活化劑等。而VEGF可由多種信號分子包括低氧、腫瘤壞死因子、NO、成纖維細(xì)胞生產(chǎn)因子、白細(xì)胞介素-1及胰島素生長因子等誘導(dǎo)產(chǎn)生。益肺飲與CIK細(xì)胞聯(lián)用時對TGF-β1及VEGF的分泌產(chǎn)生不同抑制效果的原因，或許與其抑制機(jī)制有關(guān)，這需要之后進(jìn)一步的深入研究。

通過本研究，我們雖然未取得預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，益肺飲聯(lián)合CIK細(xì)胞并不能增強(qiáng)對肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制及抗凋亡效應(yīng)，同時也沒有對VEGF的分泌產(chǎn)生更明顯的抑制效果。但是我們證實(shí)了益肺飲聯(lián)合CIK可以有效降低A549細(xì)胞分泌TGF-β。這為我們臨床使用益肺飲治療肺癌患者提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，同時為進(jìn)一步研究益肺飲對免疫逃逸干預(yù)的機(jī)制提供了研究方向。

近年來，腫瘤的免疫治療是最具有前景也是最熱門的研究之一。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn)，為腫瘤的免疫治療打開了一扇新的大門，越來越多的免疫檢查靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，如CTLA-4、PD-1、TIM3、LAG-3、CD122等[14-15]。關(guān)于肺癌的免疫治療一直是研究熱點(diǎn)，免疫治療聯(lián)合化療已經(jīng)成為治療非小細(xì)胞肺癌一線方案[16]。大量的研究表明，中藥能夠通過多種機(jī)制來調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞免疫抑制[17]，因此，中醫(yī)藥聯(lián)合免疫治療是一個很有價值的研究方向，同時面對越來越豐富的免疫治療，如何避免免疫治療耐藥，又將為中醫(yī)藥的研究提供一個新的思路。

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