彭夢(mèng)媛 邱峰 黃丹 秦霞 張淵

摘 要 目的：研究姜黃素對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞耐吉西他濱（GEM）的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制。方法：采用CCK8法檢測(cè)不同濃度（50、100、150、200、250 μmol/L）GEM對(duì)SW1990細(xì)胞和耐GEM SW1990細(xì)胞（SW1990/GEM耐藥細(xì)胞）存活率的影響，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥倍數(shù)；采用CCK8法檢測(cè)不同濃度（1、5、10、20、40 μmol/L）姜黃素對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞存活率的影響，計(jì)算IC50；采用CCK8法檢測(cè)2.41 μmol/L姜黃素與不同濃度（25、50、75、100、125 μmol/L）GEM聯(lián)用對(duì)SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞存活率的影響，計(jì)算GEM的IC50和耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)以GEM的IC50為給藥濃度，GEM單用、姜黃素（2.41 μmol/L）與GEM聯(lián)用處理SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，并采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中脂肪酸合成酶（FAS）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）及其相關(guān)X蛋白（Bax）的蛋白表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)mRNA表達(dá)。結(jié)果：GEM對(duì)SW1990細(xì)胞的IC50為92 μmol/L，對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的IC50為216 μmol/L，SW1990細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥倍數(shù)為2.35；姜黃素對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的IC50為9.2 μmol/L；2.41 μmol/L姜黃素下，GEM對(duì)SW1990細(xì)胞的IC50為75 μmol/L，對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的IC50為98 μmol/L，SW1990/GEM耐藥細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.2。與GEM單用比較，姜黃素與GEM聯(lián)用時(shí)SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的凋亡率均明顯升高（P<0.05），主要阻滯在G0/G1期，細(xì)胞中FAS、p-AKT、p-PI3K、Bcl-2蛋白表達(dá)水平和FAS、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05），Bax、Cascapse-3蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）。結(jié)論：姜黃素可逆轉(zhuǎn)SW1990細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥性，其機(jī)制可能與PI3K/AKT通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 姜黃素；吉西他濱；胰腺癌SW1990細(xì)胞；耐藥；凋亡；機(jī)制

Reversal Effects of Curcumin on Gemcitabine-resistant Pancreatic Cancer SW1990 Cells and Its Mechanism Study

PENG Mengyuan，QIU Feng，HUANG Dan，QIN Xia，ZHANG Yuan（Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of curcumin on gemcitabine （GEM）-resistant pancreatic cancer SW1990 cells and its mechanism. METHODS： CCK8 assay was used to detect the effects of different concentrations of GEM （50， 100， 150， 200， 250 μmol/L） on the survival rate of SW1990 cells and GEM-resistant SW1990 cells （SW1991/GEM resistant cells）； half inhibitory concentration （IC50） and drug resistance multiple were calculated. CCK8 assay was performed to detect the effects of different concentrations of curcumin （1， 5， 10， 20， 40 μmol/L） on survival rate of SW1990/GEM resistant cells， and IC50 was calculated. CCK8 assay was used to detect the effects of curcumin 2.41 μmol/L combined with different concentrations of GEM （25， 50， 75， 100， 125 μmol/L） on the survival rate of SW1990 cells and SW1990/GEM resistant cells， and IC50 and drug resistance reversal fold of GEM were calculated. Flow cytometry was carried out to detect the cell cycle distribution and apoptosis rate of SW1990 after treated with GEM alone or curcumin （2.41 μmol/L） combined with GEM using IC50 of GEM as drug concentration. Western blot assay was used to the protein expression of FAS， AKT， p-AKT， PI3K， p-PI3K， Caspase-3， Bcl-2 and related X protein （Bax）. RT-PCR was used to detect mRNA expression. RESULTS： IC50 of GEM to SW1990 cells was 92 μmol/L. IC50 of GEM to SW1990/GEM resistant cells was 216 μmol/L， and drug resistance multiple SW1990 cells to GEM was 2.35. IC50 of curcumin to SW1990/GEM resistant cells was 9.2 μmol/L. Under 2.41 μmol/L curcumin， IC50 of GEM to SW1990 cells was 75 μmol/L， and IC50 of GEM to SW1990/GEM resistant cells was 98 μmol/L； drug resistance reversal multiple of SW1990/GEM resistant cells to GEM was 2.2. Compared with GEM alone， the apoptosis rate of SW1990 cells and SW1990/GEM resistant cells were increased significantly after curcumin combined with GEM （P<0.05）， blocking at G0/G1 phase； the protein expression of FAS， p-AKT， p-PI3K and Bcl-2 and mRNA expression of FAS and Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）； the protein and mRNA expression of Bax and Caspase-3 were increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Curcumin can reverse drug resistance of SW1990 cells to GEM， the mechanism of which may be associated with PI3K/AKT pathway.

KEYWORDS Curcumin； Gemcitabine； Pancreatic cancer SW1990 cell； Drug resistance； Apoptosis； Mechanism

胰腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而吉西他濱（Gemcitabine，GEM）是目前臨床上常用的針對(duì)胰腺癌的化療藥物[1-2]。胰腺癌細(xì)胞對(duì)GEM耐藥可能是耐藥相關(guān)蛋白導(dǎo)致藥物攝取減少或藥物外排增加，或改變了細(xì)胞凋亡途徑的活性，而影響細(xì)胞凋亡途徑的主要機(jī)制是非典型耐藥相關(guān)蛋白導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)及磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、磷酸化的蛋白激酶B（p-AKT）等信號(hào)調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性改變等[3]。研究證實(shí)，異常的脂肪代謝與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[4-6]，包括胰腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝所需要的腺苷三磷酸（ATP）也來(lái)源于脂肪酸的代謝。脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是脂類物質(zhì)合成過(guò)程中的限速酶，是脂質(zhì)合成中的關(guān)鍵酶[7]，大量研究表明，F(xiàn)AS與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是代謝性致癌基因[8-9]。有研究表明，胰腺癌細(xì)胞中FAS表達(dá)異?；蚣?xì)胞中脂質(zhì)代謝異常均與胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性有關(guān)[10-11]。姜黃素作為一種天然存在的FAS抑制劑，能抑制多種癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[12-13]，但關(guān)于其是否也對(duì)胰腺癌耐藥細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)作用及其是否也是通過(guò)FAS發(fā)揮耐藥逆轉(zhuǎn)作用及作用機(jī)制的相關(guān)研究較少，本文就此進(jìn)行了研究。

有研究表明，應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002與GEM共處理GEM耐藥的胰腺癌細(xì)胞，細(xì)胞明顯表現(xiàn)出凋亡，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)GEM誘導(dǎo)凋亡的增加與p-AKT減少密切相關(guān)[14]。因此筆者推測(cè)，姜黃素可能通過(guò)影響PI3K/AKT通路及其下游相關(guān)因子逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥性。綜上，在本研究中，筆者采用人胰腺癌細(xì)胞株SW1990和耐GEM SW1990細(xì)胞株（SW1990/GEM耐藥細(xì)胞），以流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期的分布，初步分析姜黃素對(duì)SW1990細(xì)胞耐GEM的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

HH-CP-01W CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司）；Bio-Plex200流式細(xì)胞儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；DA7600實(shí)時(shí)定量核酸擴(kuò)增熒光（qPCR）檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

姜黃素原料藥（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBN7214V，純度：≥97%）；注射用鹽酸吉西他濱（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160802，規(guī)格：1.0 g）；胎牛血清（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號(hào)：11061-1125）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Corning公司，批號(hào)：05118006）；CCK8試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C0037、P0202、C1062M）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒和Trizol試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：C503021-0500、B511311- 0100）；反轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒和qPCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AE101、AQ101-01）；鼠抗人PI3K、AKT、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）及其相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc- 7480、sc-7272、sc-7382、sc-7412、sc-7469、sc-47724）；鼠抗人FAS單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ZA-0005）。

1.3 細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞SW1990購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素溶液的制備

姜黃素臨用時(shí)以少量二甲基亞砜（DMSO）溶解姜黃素對(duì)照品，再加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMSO終體積分?jǐn)?shù)<0.01%）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SW1990細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25 g/L的胰酶消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，利用GEM濃度梯度遞增法建立人胰腺癌SW1990/GEM耐藥細(xì)胞，以3 μmol/L的GEM維持細(xì)胞耐藥性。SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞均采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 GEM對(duì)SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用

消化SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，接種于 96 孔板，每孔 3×103個(gè)；置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液加入不同濃度（50、100、150、200、250 μmol/L）的GEM溶液（溶劑為生理鹽水），每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的空白組。每孔終體積為200 μL；再置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入含CCK8試劑10 μL的培養(yǎng)液200 μL，染色2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A），計(jì)算SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的存活率，以GEM的不同濃度與細(xì)胞的存活率作圖，確定細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），再計(jì)算SW1990細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥倍數(shù)。存活率=A給藥組/A空白組×100%，耐藥倍數(shù)=IC50（SW1990/GEM耐藥細(xì)胞）/IC50（SW1990細(xì)胞）。結(jié)果顯示，GEM對(duì)SW1990細(xì)胞的IC50（92 μmol/L）顯著低于對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的IC50（216 μmol/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明GEM對(duì)SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用，SW1990細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥倍數(shù)為2.35。不同濃度GEM對(duì)SW1990細(xì)胞與SW1990/GEM耐藥細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖1。

2.5 姜黃素對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用

消化SW1990/GEM耐藥細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔 3×103個(gè)；置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液加入不同濃度的姜黃素（1、5、10、20、40 μmol/L），每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的空白組。按“2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)48 h，加入CCK8試劑染色后，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的A，計(jì)算存活率，并以藥物的不同濃度與細(xì)胞的存活率作圖，確定細(xì)胞的IC50。結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性，IC50為9.2 μmol/L。為了避免細(xì)胞增殖抑制作用是由姜黃素引起的，后期選擇無(wú)顯著細(xì)胞毒性（細(xì)胞抑制率小于15%）的姜黃素濃度2.41 μmol/L作為聯(lián)用時(shí)的試驗(yàn)濃度。不同濃度姜黃素對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖2。

2.6 姜黃素聯(lián)用GEM對(duì)SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用

取SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞，分別用2.41 μmol/L的姜黃素聯(lián)合不同濃度的GEM（25、50、75、100、125 μmol/L）進(jìn)行處理，培養(yǎng)48 h，加入CCK8試劑染色后，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的A，計(jì)算存活率，確定聯(lián)用2.41 μmol/L姜黃素條件下GEM的IC50，再計(jì)算聯(lián)用2.41 μmol/L姜黃素條件下SW1990/GEM耐藥細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC50（SW1990/GEM耐藥細(xì)胞+GEM）/IC50（SW1990/GEM耐藥細(xì)胞+姜黃素+GEM）。結(jié)果顯示，姜黃素與GEM聯(lián)合處理細(xì)胞后，GEM對(duì)SW1990細(xì)胞的IC50為75 μmol/L，低于GEM單用時(shí)的IC50（92 μmol/L）；對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的IC50為98 μmol/L，明顯低于GEM單用時(shí)的IC50（216 μmol/L）（P<0.05），聯(lián)用2.41 μmol/L姜黃素條件下SW1990/GEM耐藥細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.2。姜黃素聯(lián)用不同濃度GEM對(duì)SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖3。

2.7 姜黃素聯(lián)用GEM對(duì)SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞周期和凋亡的影響

取SW1990細(xì)胞分為SW1990+GEM組（SW1990細(xì)胞+92 μmol/L GEM）、SW1990聯(lián)用組（SW1990細(xì)胞+75 μmol/L GEM+2.41 μmol/L姜黃素處理）；取SW1990/GEM耐藥細(xì)胞分為SW1990/GEM+GEM組（SW1990/GEM耐藥細(xì)胞+216 μmol/L GEM）、SW1990/GEM聯(lián)用組（SW1990/GEM耐藥細(xì)胞+98 μmol/L GEM+2.41 μmol/L姜黃素），加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)48 h后，經(jīng)胰酶消化，PBS沖洗3次，離心取沉淀，每組加入 1×Annexin Ⅴ結(jié)合緩沖液100 μL，充分混勻細(xì)胞后，加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液和5 μL 碘化丙啶（PI）染液，室溫避光孵育15 min，然后每管加300 μL 1×Annexin Ⅴ結(jié)合緩沖液，孵育1 h后，使用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率和周期分布。結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)的GEM組比較，聯(lián)用組SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的凋亡率均明顯升高（P<0.05），主要阻滯在G0/G1期。4組細(xì)胞凋亡的散點(diǎn)圖見(jiàn)圖4，凋亡率的測(cè)定結(jié)果圖5，周期分布的流式圖見(jiàn)圖6，周期分布的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.8 細(xì)胞中FAS、PI3K、AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)

細(xì)胞分組與給藥同“2.7”項(xiàng)下，培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，于 4 ℃，12 000 r/min離心10 min，提取細(xì)胞總蛋白，取 25 μg 蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，100 V 恒壓電泳2 h，分離蛋白，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)模，室溫下用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入鼠抗人FAS（1 ∶ 500）、PI3K（1 ∶ 500）、AKT（1 ∶ 500）、Bcl-2（1 ∶ 500）、Bax（1 ∶ 500）、Caspase-3（1 ∶ 500）單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜3次，并選擇相應(yīng)的二抗（1 ∶ 2 000）室溫孵育2 h，再用TBST緩沖液洗膜3次，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）液顯示免疫印跡條帶，試驗(yàn)重復(fù)3次。以目標(biāo)條帶與內(nèi)參GAPDH的比值評(píng)價(jià)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)的GEM組比較，聯(lián)用組SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞中FAS、p-AKT、p-PI3K、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。4組細(xì)胞中FAS、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖8，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9。

2.9 RT-PCR法檢測(cè)FAS、PI3K、AKT、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá)

細(xì)胞分組與給藥同“2.7”項(xiàng)下，培養(yǎng)48 h后，經(jīng)胰酶消化，收集細(xì)胞，用Trizol裂解細(xì)胞后試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用PCR擴(kuò)增后測(cè)RNA表達(dá)水平。其中反轉(zhuǎn)錄的引物由上海生工生物科技技術(shù)有限公司合成，其中FAS的引物：上游5′ -CTCCAAGGGATTGGAATTGA-3′ ，下游5′ -TTGGTGTTGCTGGTGAGTGT-3′ ，片段長(zhǎng)度296 bp；AKT的引物：上游5′ -CTCATTCCAGACCCACGAC-3′ ，下游5′ - ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3′ ，片段長(zhǎng)度242 bp；PI3K的引物：上游5′ -GCCCAGGCTTACTACAGAC-3′ ，下游5′ -AAGTAGGGAGGCATCTCG-3′ ，片段長(zhǎng)度236 bp；Bcl-2的引物：上游5′ -TTCTTTGAGTTCGGTGGGG- TC-3′ ，下游：5′ -TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′ ，片段長(zhǎng)度304 bp；Bax的引物：上游5′ -TCCACCAAGAA- GCTGAGCGAG-3′ ，下游 5′ -GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′，片段長(zhǎng)度257 bp ；Caspase-3的引物：上游5′ -TGGAATTGATGCGTGATGTT-3′ ，下游5′ -GTCGGCATACTGTTTCAGCA-3′ ，片段長(zhǎng)度834 bp；內(nèi)參β-actin的引物：5-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3′ ，下游5′ -GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′ ，片段長(zhǎng)度268 bp。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)的GEM組比較，聯(lián)用組SW1990細(xì)胞和SW1990/GEM耐藥細(xì)胞細(xì)胞中FAS、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。4組細(xì)胞中FAS、AKT、PI3K、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖10。

3 討論

GEM是臨床治療胰腺癌的一線藥物，但在化療過(guò)程中，由于耐藥性的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了化療的效果。有研究表明，逆轉(zhuǎn)耐藥性可顯著提升臨床的治療效果[16]。另一方面，腫瘤細(xì)胞為了滿足自身增殖、生長(zhǎng)的需要，需要不斷從臨近組織中獲取能量，必然要通過(guò)異常的脂質(zhì)代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)，而FAS是脂質(zhì)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。在本試驗(yàn)中，通過(guò)前期預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)到胰腺癌組織及癌旁組織中FAS的表達(dá)量，結(jié)果顯示FAS在癌組織中高表達(dá)，表明FAS的過(guò)表達(dá)可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。姜黃素是一種天然存在的FAS抑制劑，能通過(guò)抑制FAS的表達(dá)而抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用；在姜黃素濃度為2.41 μmol/L時(shí)，對(duì)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，但與GEM聯(lián)用后，其抑制率又顯著升高。接著采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，姜黃素使更多SW1990細(xì)胞與SW1990/GEM耐藥細(xì)胞處在G0/G1期進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。通過(guò)以上結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)姜黃素能增敏GEM化療胰腺癌SW1990/GEM耐藥細(xì)胞株的效果，兩種藥物聯(lián)合使用可以更有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。

PI3K/AKT信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、存活、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥性等方面產(chǎn)生非常關(guān)鍵的效應(yīng)，而通路中某些成分變化可導(dǎo)致其功能發(fā)生改變[17]。Bax、Bcl-2共屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，通常情況下Bcl-2和Bax兩種蛋白表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，而當(dāng)Bax處于高表達(dá)狀態(tài)，Bax-Bax同源二聚體數(shù)量明顯增多，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)凋亡開(kāi)始[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道姜黃素可以影響 PI3K/AKT通路的活化，下調(diào)凋亡抑制蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[19]。由此推測(cè)，姜黃素有可能通過(guò)改變PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)而逆轉(zhuǎn)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞的耐藥。通過(guò)Western blot法檢測(cè)該通路及其下游凋亡相關(guān)蛋白，研究結(jié)果顯示，在聯(lián)用組中，PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平下降，Bax與凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3表達(dá)水平均升高。該結(jié)果提示，姜黃素聯(lián)用 GEM能影響PI3K/AKT信號(hào)途徑及其下游因子，其逆轉(zhuǎn)SW1990/GEM耐藥細(xì)胞耐藥，可能是通過(guò)下調(diào)PI3K蛋白表達(dá)，減少AKT磷酸化水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平，同時(shí)激發(fā)Bax-Bax同源二聚體對(duì)死亡信號(hào)的響應(yīng)，活化Caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)有研究表明，棕櫚酸能對(duì)脂肪酸合酶抑制劑造成的細(xì)胞能量不足進(jìn)行補(bǔ)救[20]，從反面表明姜黃素作為FAS抑制劑可通過(guò)引起胰腺癌細(xì)胞能量不足，影響細(xì)胞存活及正常凋亡，增加了SW1990細(xì)胞對(duì)GEM的敏感性。總之，姜黃素可能通過(guò)影響PI3K/AKT通路逆轉(zhuǎn)SW1990細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥性。這些結(jié)果可為臨床治療胰腺癌中患者出現(xiàn)化療耐藥性時(shí)提供新的解決思路。

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（收稿日期：2019-01-15 修回日期：2019-03-20）

（編輯：鄒麗娟）