黃彭 曲佳琳 常樂 柯紅文 楊迎 冷愛晶

摘 要 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究金錢草治療膽囊相關(guān)疾病的作用機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），以“類藥五原則”和“口服吸收利用度（OB）>30%”為標(biāo)準(zhǔn)篩選金錢草活性成分，預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)，并利用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)；在數(shù)據(jù)庫TTD、OMIM、PharmGKB、DrugBank和GAD中，以“膽石癥”“膽結(jié)石”“膽囊炎”和“膽管炎”為關(guān)鍵詞預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并與活性成分作用靶點(diǎn)融合，獲得治療靶點(diǎn)，使用數(shù)據(jù)庫DAVID對靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，以靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對接，以此篩選出金錢草發(fā)揮治療作用的主要成分。結(jié)果：篩選獲得金錢草中具有類藥性、口服吸收較好的27種成分；通過網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、融合得到金錢草作用靶點(diǎn)33個(gè)，通路富集分析得到相關(guān)通路7條，主要涉及癌癥通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體通路等；金錢草活性成分中對接得分排序前4位的分別是山柰酚、金合歡素、橙皮素和異鼠李素，主要作用于ABCC3、ABCB1、ABCC2、ABCB4靶點(diǎn)。結(jié)論：金錢草主要通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體通路發(fā)揮治療膽囊相關(guān)疾病的作用。

關(guān)鍵詞 金錢草；膽囊相關(guān)疾??；靶點(diǎn)；通路；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；作用機(jī)制

Study on Network Pharmacology of the Mechanism of Lysimachia christinae in the Treatment of Cholecyst Related Disease

HUANG Peng1，2，QU Jialin1，CHANG Le3，KE Hongwen4，YANG Ying1，2，LENG Aijing2，5（1.Clinical Laboratory of Integrative Medicine， the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116011， China；2.Institute of Integrative Medicine， Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116044， China；3.Jinzhou Institute for Drug Control， Liaoning Jinzhou 121000， China；4.Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116011， China；5.Dept. of Traditional Chinese Medicine， the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116011， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the mechanism of Lysimachia christinae in the treatment of cholecyst related diseases by network pharmacology. METHODS： The active ingredients of L. christinae were screened through TCMSP database with “Lipinski rule” and “Oral bioavailability >30%” rules， and their related targets were predicated correspondingly， then compound-target network were constructed by Cytoscape 3.2.1 software. Disease related targets were predicted by searching TTD database， OMIM database， PharmGKB database， DrugBank database and GAD database with “cholelithiasis” “gallstones” “cholecystitis” and “cholangitis” as keywords. Then， the network of disease-target was constructed and merged with active ingredient target to obtain therapeutic target. After pathway enrichment analysis of therapeutic target were performed by utilizing the DAVID database， molecular docking between target and active ingredient was also conducted in order to screen the main active ingredients of L. christinae. RESULTS： Twenty-seven active ingredients with good oral absorption and drug-like properties were screened from L. christinae. Thirty-three targets were attained after constructing and merging the network. Seven pathways， mainly related to cancer pathway and ABC transporter pathway were achieved. Top 4 active ingredients of L. christinae in the list of docking score were kaempferin， acacia， hesperetin and isorhamnetin， which acted on ABCC3， ABCB1， ABCC2， ABCB4 target. CONCLUSIONS： L. christinae treat cholecyst related diseases through ABC transporter pathway.

KEYWORDS Lysimachia christinae； Cholecyst related diseases； Target； Pathway； Network pharmacology； Mechanism

金錢草始載于《本草綱目拾遺》，為報(bào)春花科植物過路黃（Lysimachia christinae Hance）的干燥全草，其味甘、咸，性微寒，歸肝、膽、腎和膀胱經(jīng)，具有利濕退黃、利尿通淋和解毒消腫等功效，常用于治療石淋、熱淋、小便澀痛、濕熱黃疸、膽脅脹痛、癰腫疔瘡和蟲蛇咬傷等[1-2]。在我國，中醫(yī)藥治療急性和慢性疾病已有數(shù)千年的歷史，包括其在膽結(jié)石防治中的應(yīng)用也引起了越來越多的關(guān)注。根據(jù)對歷代醫(yī)家組方規(guī)律的分析結(jié)果顯示[3]，金錢草在膽結(jié)石防治的組方中的用藥頻率居于前列。但是，其作用機(jī)制的研究也僅局限于單個(gè)蛋白水平，難以體現(xiàn)金錢草多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，也難以體現(xiàn)中醫(yī)藥整體性的特點(diǎn)。與化學(xué)藥不同，單味中藥常包含多種化學(xué)成分和多個(gè)作用靶點(diǎn)[4]，這也使得對中藥作用機(jī)制的系統(tǒng)性研究存在困難。隨著生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的快速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為中醫(yī)從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)向循證醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化提供了新的研究范式，將極大地促進(jìn)中醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展[5]。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可以篩選中藥成分之間的協(xié)同作用，更好地解釋中藥治療疾病“多成分-多靶點(diǎn)”的作用特點(diǎn)，由此進(jìn)一步探究“中藥-疾病”之間的關(guān)系。本研究旨在篩選金錢草中具有成藥性、口服吸收效果較好的活性成分，預(yù)測活性成分與膽囊相關(guān)疾病的靶點(diǎn)及信號通路，為金錢草治療膽囊相關(guān)疾病的系統(tǒng)性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）；網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.2.1（http：//www.cytoscape.org）；藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic target database，TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）；人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//omim.org/）；藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)知識庫（Pharmacogenetics and pharmacogenomics knowledge base，PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/）；藥物銀行（DrugBank）數(shù)據(jù)庫（http：//www.drugbank.ca/）；遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（Genetic association database，GAD，https：//geneticassociationdb.nih.gov/）；基因疾病大集合數(shù)據(jù)庫（DisGeNET，http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID V6.8 （https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）；Systems Dock 在線分子對接工具（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/ index）。

1.2 金錢草活性成分的篩選

口服給藥是一種方便、經(jīng)濟(jì)及安全的給藥途徑，由于一些成分在水中的溶解度很低，經(jīng)口服吸收后效果不理想，因此，本研究通過“類藥五原則”和“口服吸收度（OB）”來篩選金錢草中的可被吸收成分。通過TCMSP[6]，依據(jù)“類藥五原則”（本文選擇簡化后的四原則）和 “OB”進(jìn)行篩選，篩選原則為：相對分子質(zhì)量（MW）≤500、油水分配系數(shù)（AlogP）≤5、氫鍵供體數(shù)（Hdon）≤5、氫鍵受體數(shù)（Hacc）≤10、OB>30%[7]，由此獲得金錢草中可被口服吸收的活性成分，列出MOL ID編號。

1.3 金錢草活性成分靶點(diǎn)的整理

基于所篩選的成分，從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得成分的InChI Key（一種用來識別化合物的文本）、Canonical SMILES（簡化分子線性輸入規(guī)范）和CAS number（物質(zhì)數(shù)字識別號碼）。然后，利用InChI Key或Canonical SMILES從TCMSP獲得成分靶點(diǎn)，再利用Canonical SMILES從SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫[8]中獲得成分靶點(diǎn)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)去重復(fù)后合并。

1.4 金錢草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選所得成分和相關(guān)靶點(diǎn)輸入到Cytoscape 3.2.1中構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，用以闡明金錢草發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。Cytoscape 3.2.1作為一個(gè)可視化的網(wǎng)絡(luò)工具[9]，在一個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中，“節(jié)點(diǎn)”表示基因、中藥、成分、疾病或疾病的臨床表型，“邊”是一種聯(lián)系，節(jié)點(diǎn)的“度”是與之相連的邊的數(shù)目[5]。度值越大，表明活性成分通過該靶點(diǎn)發(fā)揮的治療作用越大。

1.5 膽囊相關(guān)疾病靶點(diǎn)的整理及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“膽石癥”“ 膽結(jié)石”“膽囊炎”和“膽管炎”為關(guān)鍵詞，依次從以下數(shù)據(jù)庫中獲得各疾病相關(guān)靶點(diǎn)：（1）TTD[10]，（2）OMIM[11]，（3）PharmGKB[12]，（4）DrugBank[13]，（5）GAD[14]，（6）DisGeNET datebase[15]。將上述6個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)去重匯總即為各疾病靶點(diǎn)，然后利用Cytoscape 3.2.1構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 金錢草成分靶點(diǎn)和膽囊相關(guān)疾病靶點(diǎn)的集合

利用Cytoscape 3.2.1中Merged 功能，將成分-靶點(diǎn)和疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行合并，選取二者共同作用的靶點(diǎn)，即為金錢草發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)。

1.7 京都基因與基因組百科全書通路富集分析

為了進(jìn)一步闡明金錢草的作用機(jī)制，通過生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID V6.8對作用靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG） 通路富集，設(shè)定“Background”為“Homo sapiens”，根據(jù)通路富集結(jié)果，并以P<0.05作為顯著功能和通路的臨界值，利用Cytoscape 3.2.1進(jìn)行成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.8 分子對接和靶點(diǎn)驗(yàn)證

為了進(jìn)一步評價(jià)靶蛋白與成分之間的相互作用關(guān)系，采用Systems Dock 在線分子對接工具，對目的蛋白和化合物分子進(jìn)行分子對接。首先需下載蛋白的3D結(jié)構(gòu)，輸入蛋白名，上傳蛋白結(jié)構(gòu)文件及化合物結(jié)構(gòu)信息，按照提示步驟操作進(jìn)行對接，可以得到靶蛋白與化合物分子的對接結(jié)果，包括對接得分和柱狀圖等結(jié)果。根據(jù)分值大小對配體與受體的結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行判斷分析，得到金錢草發(fā)揮治療作用的主要成分。

2 結(jié)果

2.1 金錢草活性成分篩選

通過“類藥五原則”和“OB”來篩選金錢草中的可被吸收成分，共獲得27種成分，成分信息見表1。

2.2 金錢草活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測和成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用TCMSP和Swiss Target Prediction獲得成分靶點(diǎn)，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)去重后得到296個(gè)（例如NFKBIA、CASP9、AHSA1、ABCB1、UGT2B4、ACHE、AKR1E2、CHRNA2等）靶點(diǎn)。

利用Cytoscape3.2.1構(gòu)建金錢草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

由圖1可見，網(wǎng)絡(luò)包括323個(gè)節(jié)點(diǎn)（27個(gè)成分節(jié)點(diǎn)，296個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)），構(gòu)成了851條相互作用關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)中，靶點(diǎn)PTGS2（前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2）、CHRM2（M2-乙酰膽堿能受體基因）、CHRM1（毒蕈堿型膽堿受體M1）、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體基因SLC6A2、GABRA1（γ-氨基丁酸A受體α1）、PTGS1（過氧化物合酶1）和成分MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000354（異鼠李素）具有較高的度值，提示這些可能是發(fā)揮療效的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)也體現(xiàn)了金錢草“多成分”和“多靶點(diǎn)”的作用特點(diǎn)。

2.3 金錢草活性成分靶點(diǎn)和膽囊相關(guān)疾病靶點(diǎn)的集合

構(gòu)建的疾病-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

由圖2可見，4種膽囊相關(guān)疾病與258個(gè)靶點(diǎn)之間有相互作用。使用Cytoscape 3.2.1 的Merged功能，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)融合，取其交集部分構(gòu)建活性成分-治療靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，得到金錢草中發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)33個(gè)?；钚猿煞?治療靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。

2.4 KEGG通路富集分析和金錢草活性成分-治療靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過DAVID數(shù)據(jù)庫平臺進(jìn)行KEGG通路富集分析，以進(jìn)一步探究金錢草活性成分-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中33個(gè)靶蛋白的作用機(jī)制。結(jié)果，33個(gè)靶點(diǎn)中有20個(gè)涉及到7條通路（P<0.05），詳見表2（各靶點(diǎn)中文名略）。

利用Cytoscape 3.2.1將活性成分-治療靶點(diǎn)、疾病-靶點(diǎn)和靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)合并，得到活性成分、治療靶點(diǎn)以及通路之間的關(guān)系，見圖4；從圖4網(wǎng)絡(luò)中篩去癌癥信號通路和免疫信號通路，重新構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，得到金錢草治療膽囊相關(guān)疾病的活性成分-治療靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5（由于與膽囊炎相關(guān)的度值為0，故在圖中未顯示）。

從圖5可以看出，三磷酸腺苷結(jié)合盒B亞家族成員4（ABCB4）度值較大，多數(shù)活性成分作用于ABCB4發(fā)揮治療作用。

2.5 分子對接和靶點(diǎn)驗(yàn)證

利用Systems Dock在線分子對接工具，對ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體通路靶蛋白和活性成分進(jìn)行分子對接。其中度值較高的4種活性成分與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體通路中4種靶蛋白的分子對接得分結(jié)果見圖6，表明這4種成分是金錢草發(fā)揮治療作用的主要成分。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為多靶點(diǎn)聯(lián)合用藥提供了一個(gè)新的方向，并且已經(jīng)成功運(yùn)用于中藥的機(jī)制研究中。如已利用網(wǎng)路藥理學(xué)方法，成功地預(yù)測了沙棘總黃酮[16]和白術(shù)-枳實(shí)[17]治療疾病的作用機(jī)制。本研究采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，首先對金錢草中的成分進(jìn)行篩選，并預(yù)測活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，然后對膽囊相關(guān)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行搜索，構(gòu)建疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，最后對成分-靶點(diǎn)和疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行融合，篩選共同的交集靶點(diǎn)，構(gòu)建活性成分-治療靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，分析得到金合歡素、橙皮素和異鼠李素具有較強(qiáng)的生理活性。已有文獻(xiàn)報(bào)道，金錢草通過抑制草酸鈣晶體生長和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[18-19]發(fā)揮治療膽石癥功效，其活性成分主要包括多糖[20]、槲皮素和山柰酚[21]。通過對交集靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，構(gòu)建活性成分-治療靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，對靶點(diǎn)、通路相關(guān)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步篩選，得到金錢草活性成分通過ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體通路發(fā)揮治療膽石癥的作用，參與到其中的基因有ABCC3、ABCB1、ABCC2和ABCB4。作為膽固醇的主要載體和溶劑，磷脂對膽鹽誘導(dǎo)的膽道黏膜損傷有保護(hù)作用[19]。ABCB4基因編碼的蛋白是一種磷脂酰膽堿易位酶，可將磷脂從小管膜的脂質(zhì)雙層的內(nèi)葉轉(zhuǎn)運(yùn)到外葉，維護(hù)膽固醇代謝的平衡和穩(wěn)定[22-24]。ABCB4的突變可導(dǎo)致膽汁淤積，其特點(diǎn)是膽汁卵磷脂排出量降低，混合膠束的形成受損，以及產(chǎn)生具有強(qiáng)力親水性膽汁，導(dǎo)致膽小管膜損傷[25-27]。所以，ABCB4 基因及其編碼的蛋白在膽汁及脂類轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用。此外，ABCB4也對膽管炎有治療作用[28]，因此，ABCB4也被認(rèn)為是金錢草發(fā)揮作用的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

探究中藥的作用機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多成分、多靶點(diǎn)。本研究將“類藥五原則”和OB>30%作為篩選金錢草活性成分的原則，得到27種活性成分，結(jié)合靶點(diǎn)、通路分析發(fā)現(xiàn)，金錢草主要通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮治療膽囊相關(guān)疾病的作用。

本研究首次運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理方法闡明金錢草治療膽囊相關(guān)疾病的作用機(jī)制，成功分析出金錢草多成分、多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，但是，研究結(jié)果仍需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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（收稿日期：2018-11-12 修回日期：2018-12-27）

（編輯：劉 萍）