方芳 吳萬垠 楊春旭 寧雪堅 謝伶俐 斯韜

摘 要 目的：研究麥門冬湯加減方聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌移植瘤模型小鼠的抑瘤作用，并探究其可能的作用機制。方法：通過腋下接種Lewis肺癌細胞復制Lewis肺癌移植瘤小鼠模型。將60只小鼠隨機分為模型組（生理鹽水，每天灌胃1次）、順鉑組（6 mg/kg，每周腹腔注射1次）、麥門冬湯加減方組（20 g/kg，每天灌胃1次）和聯(lián)合組（每周腹腔注射6 mg/kg順鉑1次+每天灌胃20 g/kg麥門冬湯加減方1次），每組15只。所有小鼠均連續(xù)給藥2周。給藥結(jié)束后，檢測各組小鼠瘤質(zhì)量和胸腺指數(shù)，蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察其瘤體組織病理變化，TUNEL法檢測其瘤體細胞凋亡指數(shù)，Western blot法檢測其瘤體組織中B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）和促凋亡基因Bax蛋白表達。結(jié)果：與模型組比較，麥門冬湯加減方組、順鉑組和聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量、Bcl-2蛋白表達量均顯著降低（P<0.05），胸腺指數(shù)、瘤體細胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白表達量均顯著升高（P<0.05）；并且聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量、Bcl-2蛋白表達量明顯低于麥門冬湯加減方組和順鉑組（P<0.05），胸腺指數(shù)、瘤體細胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白表達量明顯高于麥門冬湯加減方組和順鉑組（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示，麥門冬湯加減方組、順鉑組和聯(lián)合組小鼠腫瘤細胞密度有所降低，腫瘤組織壞死區(qū)域增多，并且聯(lián)合組小鼠的壞死區(qū)面積明顯大于麥門冬湯加減方組和順鉑組。結(jié)論：麥門冬湯加減方可通過下調(diào)瘤組織中Bcl-2蛋白表達和上調(diào)Bax蛋白表達，從而抑制Lewis肺癌移植瘤模型小鼠腫瘤的生長。

關(guān)鍵詞 麥門冬湯加減方；順鉑；Lewis肺癌；移植瘤；B細胞淋巴瘤2；小鼠

Study on Inhibitory Effect of Modified Maimendong Decoction Combined with Cisplatin on Lewis Lung Cancer Transplantation Model Mice and Its Mechanism

FANG Fang1，2，WU Wanyin1，3，YANG Chunxu2，NING Xuejian2，XIE Lingli1，SI Tao2（1.Second Clinical Medical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510006， China；2.Dept. of Oncology， Liuzhou Hospital of TCM， Guangxi Liuzhou 545000， China；3.Dept. of Oncology， Fangcun Branch， Guangdong Provincial Hospital of TCM， Guangzhou 510370， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effect of modified Maimendong decoction combined with cisplatin on Lewis lung cancer transplantation model mice， and to explore its potential mechanism. METHODS： Lewis lung cancer transplantation mice model was induced via subaxillary inoculation of Lewis lung cancer cells. 60 mice were randomly divided into model group （normal saline， once a day， i.g.）， cisplatin group （6 mg/kg， once a week， i.p.）， modified Maimendong decoction group （20 g/kg. once a day， i.g.） and combination group （cisplatin 6 mg/kg， once a week， i.p.+modified Maimengdong decoction， once a day， i.g.）， with 15 mice in each group. All mice were treated for consecutive 2 weeks. After medication， tumor weight and thymus index were detected； HE staining was used to observe the pathological change of tumor tissue. TUNEL was used to detect apoptotic index of tumor tissue. The protein expressions of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with model group， tumor weight and protein expression of Bcl-2 were decreased significantly in modified Maimengdong decoction， cisplatin group and combination group （P<0.05）， and thymus index， tumor apoptotic index and the protein expression of Bax were increased significantly （P<0.05）. Tumor weight and protein expression of Bcl-2 in combination group were significantly lower than modified Maimengdong decoction group and cisplatin group （P<0.05）； thymus index， tumor apoptotic index and the protein expression of Bax were significantly higher than addition and subtraction of modified Maimengdong decoction group and cisplatin group （P<0.05）. HE staining showed that the density of tumor cells was decreased to certain degree in modified Maimengdong decoction group， cisplatin group and combination group； the area of necrosis area in the combination group was significantly larger than in modified Maimendong decoction group and cisplatin group. CONCLUSIONS： Modified Maimendong decoction can inhibit the growth of Lewis lung cancer transplanted tumor in mice by down-regulating the protein expression of Bcl-2 and up-regulating the protein expression of Bax.

KEYWORDS Modified Maimendong decoction； Cisplatin； Lewis lung cancer； Transplanted tumor； Bcl-2； Mice

肺癌是一種涉及遺傳及環(huán)境等多種因素的復雜病變過程，尤其與癌基因活化及抑癌基因失活密切相關(guān)[1]。B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）是臨床公認的肺癌原癌基因之一，其與促凋亡基因Bax共同影響著癌細胞的凋亡進程[2]。中醫(yī)認為肺癌的發(fā)病機制與痰瘀密切相關(guān)，肺癌患者局部伴氣滯、痰凝以及毒聚之改變[3]。麥門冬湯主要由麥冬、半夏、人參、甘草、粳米和大棗組成，是治燥方劑之一，臨床多用于治療虛熱肺痿、咳嗽瘀痰等病。本研究中的麥門冬湯加減方為柳州市中醫(yī)院腫瘤科肺癌協(xié)定方，是在傳統(tǒng)麥門冬湯方的基礎(chǔ)上去粳米、大棗，加海浮石、百合、白英、瓜蔞皮、玄參、牡蠣、鱉甲、炮山甲和靈芝而成，在柳州市中醫(yī)院腫瘤科應(yīng)用多年，并取得了良好療效。前期筆者在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，麥門冬湯加減方聯(lián)合化療治療氣陰兩虛痰濁泛肺型非小細胞肺癌能提高疾病無進展率，改善患者生活質(zhì)量[4]?；A(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，麥門冬湯加減方對肺腺癌細胞化療具有增敏作用[5]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步開展動物體內(nèi)實驗，建立Lewis肺癌移植瘤小鼠模型，探討麥門冬湯加減方聯(lián)合順鉑給藥后對模型小鼠的抑瘤作用，為進一步闡明其抑瘤機制及其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

PB100高速組織勻漿機（美國Wheaton公司）；Frontier 5000離心機（美國Ohaus公司）；XSP-2C生物顯微鏡（上海光學儀器廠）；IVIS小動物活體光學成像系統(tǒng)（美國Perkin Elmer公司）。

1.2 藥品與試劑

麥門冬湯加減方湯劑（柳州市中醫(yī)院制劑室，批號：0612051，規(guī)格：200 mL，每1 mL藥液中含生藥量為1.32 g）；順鉑注射液（南京制藥廠有限公司，批號：20070202，規(guī)格：20 mg/20 mL）；Bcl-2、Bax多克隆山羊抗人抗體（美國Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、小鼠抗地高辛單克隆抗體[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；小鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（上海心語生物科技有限公司）。

1.3 動物

SPF級C57BL/6J小鼠60只，♀♂各半，鼠齡6周，體質(zhì)量18～20 g，購自南京斯科瑞生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2017-0003。購入后將小鼠飼養(yǎng)于溫度為20～22 ℃、相對濕度為50%～70%、明暗各12 h交替的動物房中，飼養(yǎng)期間自由攝食和飲水。

1.4 細胞

Lewis肺癌細胞由南京大學醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室提供。

2 方法

2.1 麥門冬湯加減方的制備

分別稱取人參15 g、生地黃15 g、海浮石30 g、麥冬15 g、百合30 g、白英30 g、瓜蔞皮15 g、玄參15 g、法半夏10 g、鱉甲30 g、牡蠣30 g、炙甘草6 g、炮山甲10 g和靈芝30 g，將以上諸藥納入煎藥機中，水煎400 mL，即得。

2.2 Lewis肺癌移植瘤小鼠模型的建立

將Lewis肺癌細胞取出，水浴解凍，以含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于溫箱內(nèi)對細胞進行培養(yǎng)，環(huán)境設(shè)置為37 ℃、5% CO2。待細胞生長至對數(shù)期，且臺盼藍染率（即活細胞率）高于95%時，選用胰蛋白酶消化并制備成細胞密度為2×104個/mL的細胞懸液，備用。小鼠常規(guī)喂養(yǎng)3 d后，腋下接種上述細胞懸液（0.2 mL/只），復制Lewis肺癌移植瘤小鼠模型，造模1周后可見明顯移植瘤者表示造模成功[4]。

2.3 分組與給藥

將60只小鼠隨機分為模型組、順鉑組、麥門冬湯加減方組和聯(lián)合組，每組15只。其中，模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水；順鉑組小鼠腹腔注射6 mg/kg順鉑注射液，每周給藥1次；麥門冬湯加減方組小鼠灌胃20 g/kg麥門冬湯加減方，每天給藥1次；聯(lián)合組小鼠腹腔注射6 mg/kg順鉑注射液（每周給藥1次）+灌胃20 g/kg麥門冬湯加減方（每天給藥1次）。所有小鼠均連續(xù)給藥2周。給藥劑量根據(jù)文獻[5]并結(jié)合前期預(yù)實驗結(jié)果確定。

2.4 瘤質(zhì)量及胸腺指數(shù)測定

給藥期間，用小動物活體光學成像系統(tǒng)在給藥第1、3、7、14天檢測腫瘤成像大小并記錄信號強弱，計算腫瘤體積[5]。給藥結(jié)束后，將小鼠過度麻醉處死（處死前再次使用活體成像技術(shù)記錄瘤快大?。?，稱定其體質(zhì)量，切除瘤體及胸腺，分別稱定其質(zhì)量，根據(jù)以下公式計算胸腺指數(shù)：胸腺指數(shù)（g/10 g）=胸腺質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（10 g）[6]。

2.5 瘤體組織病理學觀察

將瘤體樣本浸泡于福爾馬林內(nèi)12 h，取出后沖洗，選用酒精脫水，二甲苯透明后，常規(guī)包埋并行4 μm切片，蘇木精染色5 min，伊紅復染2 min，封片，選用顯微鏡進行鏡檢，觀察瘤體組織病理學變化。

2.6 瘤體細胞凋亡指數(shù)檢測

采用TUNEL法檢測瘤體細胞凋亡指數(shù)。將瘤體樣本切片后，置于染色缸內(nèi)，二甲苯洗滌2次，隨后依次用95%、75%乙醇各洗滌1次。將20 μg/mL蛋白酶K滴入磷酸鹽緩沖液（PBS）內(nèi)，并加入染色缸中，在室溫下反應(yīng)10 min，取出，PBS洗滌2次，然后置于載玻片上，吸棄多余液體，滴入2 mL 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）緩沖液，室溫下反應(yīng)5 min，PBS洗滌2次，滴入2 mL小鼠抗地高辛單克隆抗體，室溫下反應(yīng)60 min，PBS洗滌2次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，甲基綠復染，封片鏡檢；隨機選取10個視野，檢測陽性染色（細胞核為棕黃色）平均光密度及陽性表達表面積，計算瘤體細胞凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)（%）=平均光密度×陽性表達表面積×100%。

2.7 瘤體組織中Bcl-2、Bax蛋白表達

采用Western blot法。將瘤體組織剪碎，PBS洗滌2次，4 500 r/min離心5 min，棄洗滌液，取出樣本置于勻漿器內(nèi)，按組織-蛋白裂解液（1 g ∶ 1 L）進行勻漿后，振蕩10 min，隨后進行95 ℃金屬浴滅活。然后以5 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法進行蛋白定量，瓊脂糖凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，選用Bcl-2、Bax（1 ∶ 50）和β-actin（1 ∶ 500）一抗，-4 ℃冷藏過夜；TBST緩沖液溶液洗膜2次，每次3 min；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 1 000），常溫下孵化3 h，TBST洗膜2次，每次3 min，發(fā)光后選用凝膠成像系統(tǒng)，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠給藥不同時間后腫瘤體積測定結(jié)果

給藥第1天，各組小鼠腫瘤體積差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。隨著給藥時間的延長，各組小鼠的腫瘤體積均不斷增加。在給藥第3、7、14天，與模型組比較，各給藥組小鼠腫瘤體積均顯著減?。≒<0.05），且聯(lián)合組小鼠腫瘤體積顯著小于麥門冬湯加減方組和順鉑組（P<0.05）。給藥不同時間后各組小鼠腫瘤體積測定結(jié)果見表1。

3.2 瘤質(zhì)量和胸腺指數(shù)測定結(jié)果

與模型組比較，各給藥組小鼠的瘤質(zhì)量均顯著降低（P<0.05），胸腺指數(shù)均顯著升高（P<0.05）；且聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量顯著低于麥門冬湯加減方組和順鉑組（P<0.05），胸腺指數(shù)顯著高于麥門冬湯加減方組和順鉑組（P<0.05）。各組小鼠瘤質(zhì)量和胸腺指數(shù)測定結(jié)果見表2。

3.3 瘤體病理組織學觀察結(jié)果

模型組小鼠瘤體組織中腫瘤細胞分布密集，細胞核較大、染色深，多呈點狀壞死；各給藥組小鼠瘤體組織中腫瘤細胞密度均有所降低、壞死區(qū)域均增多，且其中聯(lián)合組壞死區(qū)面積明顯大于麥門冬湯加減方組和順鉑組，壞死區(qū)面積呈大片狀。各組小鼠瘤體組織病理學觀察結(jié)果見圖1。

3.4 瘤體細胞凋亡指數(shù)測定結(jié)果

與模型組比較，各給藥組小鼠瘤體細胞凋亡指數(shù)均顯著升高（P<0.05），且聯(lián)合組小鼠瘤體細胞凋亡指數(shù)顯著高于麥門冬湯組和順鉑組（P<0.05）。各組小鼠瘤體細胞凋亡指數(shù)測定結(jié)果見表3。

3.5 瘤體組織中Bcl-2、Bax蛋白表達測定結(jié)果

與模型組比較，各給藥組小鼠瘤體組織中Bcl-2蛋白表達量均顯著降低（P<0.05），Bax蛋白表達量均顯著升高（P<0.05）；與麥門冬湯加減方組或順鉑組比較，聯(lián)合組小鼠瘤體組織中Bcl-2蛋白表達量進一步降低（P<0.05），Bax蛋白相對表達量進一步升高（P<0.05）。各組小鼠瘤體組織中Bcl-2、Bax蛋白表達電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表4。

4 討論

中醫(yī)將肺癌歸屬于“肺痞”“胸痛”等范疇，其病因與正氣虧虛、血瘀痰凝、邪毒入肺以及煙毒內(nèi)蘊等有關(guān)[7]。本院在挖掘中醫(yī)經(jīng)典古籍基礎(chǔ)上，結(jié)合腫瘤臨床治療的經(jīng)驗，擬合了麥門冬湯加減方。其中最典型的對藥是麥冬與半夏，麥冬滋陰潤肺兼清虛火，半夏燥濕化痰兼以散結(jié)，兩藥合用，麥冬使半夏不燥，半夏使麥冬不膩，共奏清肺降逆、活血化痰之功[8-9]，體現(xiàn)了在“燥濕相混致癌論”指導下的燥濕化痰而不傷陰、滋陰清熱而不助痰治法在肺癌治療上的具體應(yīng)用。在本研究中，給予麥門冬湯加減方后模型組小鼠瘤質(zhì)量明顯低于模型組，表明麥門冬湯加減方具有明顯的抑瘤作用，但是其作用不及聯(lián)用組。

Bcl-2是分子量為26 kD，含2個內(nèi)含子、3個外顯子的線粒體膜蛋白，其對多種因素誘導的細胞凋亡具有抑制效應(yīng)[10-11]。Bcl-2可抑制細胞色素C（Human cytochrome-C，Cyt-C）表達，促使Cyt-C活性下降從而無法激活下游含胱天蛋白酶（Caspase），阻滯Caspase的蛋白質(zhì)切割能力，以此來減少細胞的凋亡[12]。Bax是分子量為21.4 kD的促凋亡蛋白[13-14]，同屬于Bcl-2家族，其可與Bcl-2相互作用形成異二聚體，并以此抑制Bcl-2功能[15]。在本研究中，聯(lián)合組小鼠瘤體組織中Bcl-2蛋白表達量明顯低于麥門冬湯加減方組和順鉑組；與此同時，聯(lián)合組小鼠瘤體組織中Bax蛋白表達量明顯高于麥門冬湯加減方組和順鉑組。該結(jié)果提示，麥門冬湯加減方聯(lián)合順鉑可在一定程度上促進模型小鼠癌細胞凋亡，從而獲得較好的抑瘤效果。并且HE染色結(jié)果也顯示，給藥后模型小鼠瘤體組織中瘤細胞密度有所降低，壞死區(qū)域增大，其中聯(lián)合組小鼠壞死區(qū)面積明顯大于麥門冬湯加減方組和順鉑組，這表明麥門冬湯加減方聯(lián)合順鉑給藥可有效促進小鼠癌細胞凋亡，抑制小鼠癌細胞增殖。

綜上所述，麥門冬湯加減方聯(lián)合順鉑能明顯抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生長，相關(guān)作用可能與下調(diào)瘤體組織中Bcl-2蛋白表達和上調(diào)瘤體組織中Bax蛋白表達有關(guān)，但其更具體的作用機制有待進一步闡明。

參考文獻

[ 1 ] 符寶春，王濤，于新洲.利多卡因硬膜外阻滯復合全麻對肺癌患者術(shù)后相關(guān)指標的影響[J].中國藥房，2017，28（12）：1626-1629.

[ 2 ] KE L，GU X，JING L，et al. Inhibition of disheveled-2 resensitizes cisplatin-resistant lung cancer cells through down-regulating Wnt/β-catenin signaling[J]. ECR，2016，347（1）：105-113.

[ 3 ] 王紅燕.沙參麥門冬湯治療老年多重耐藥性呼吸機相關(guān)性肺炎臨床研究[J].中醫(yī)學報，2017，32（8）：1403-1406.

[ 4 ] 楊琴琴，王三虎，馮獻斌，等.潤肺散結(jié)湯治療氣陰兩虛痰濁泛肺型晚期肺鱗癌臨床研究[J].河南中醫(yī)，2010，30（7）：661-663.

[ 5 ] 方芳，謝伶俐，寧雪堅，等.麥門冬湯加減聯(lián)合順鉑對A549細胞化療增敏的作用機制[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（4）：49-56.

[ 6 ] 王美江，齊琳.外周血干細胞輸注對肺腺癌免疫行為的影響[J].中國組織工程研究，2017，21（9）：1402-1407.

[ 7 ] 丁瑞麟，謝芳，胡月，等.載內(nèi)皮抑素殼聚糖納米粒聯(lián)合順鉑對小鼠Lewis肺癌移植瘤的治療作用[J].第三軍醫(yī)大學學報，2017，39（2）：116-122.

[ 8 ] 繆苗苗，張艷霞，吳勇杰，等.蛇葡萄素鈉協(xié)同卡鉑對肺癌Lewis細胞增殖的抑制作用[J].中國藥房，2015，26（19）：2664-2666.

[ 9 ] 康荻，李彧，朱曼，等.肺痿論治干預(yù)肺纖維化大鼠肺功能的實驗研究[J].世界中醫(yī)藥，2017，12（2）：390-393.

[10] 劉珺，吳晨雯，熊紹軍.經(jīng)方麥門冬湯預(yù)防放射性肺損傷及其對血漿TGF-β1的影響[J].實用癌癥雜志，2016，31（12）：1947-1950.

[11] LI Y，QI K，ZU L，et al. Anti-apoptotic brain and reproductive organ-expressed proteins enhance cisplatin resistance in lung cancer cells via the protein kinase B signaling pathway[J]. Thoracic Cancer，2016，7（2）：190-198.

[12] 王布，張志華，顧鑫，等.川芎嗪注射液聯(lián)合順鉑注射劑對Lewis肺腺癌小鼠移植瘤生長及血管生成的抑制作用[J].中國臨床藥理學雜志，2016，32（22）：2085-2088.

[13] PAN J，WU X，WANG X，et al. NEAT1 upregulates EGCG- induced CTR1 to enhance cisplatin sensitivity in lung cancer cells[J]. Oncotarget，2016，7（28）：43337-43351.

[14] 師林，柯斌，黃圓圓，等.加味龜鹿二仙膠湯聯(lián)合順鉑對小鼠Lewis肺癌PI3K/AKT/mTOR通路的影響[J].中成藥，2017，39（10）：2148-2152.

[15] 鄧日強，程江濤，張宏華，等.蚤休薯蕷皂苷聯(lián)合順鉑抑制小鼠移植瘤生長及轉(zhuǎn)移[J].中南醫(yī)學科學雜志，2016，44（5）：504-509.

[16] 李珍，葉志華，馮娟娟.痰熱清注射液輔助化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果及其作用機制[J].山東醫(yī)藥，2016，56（20）：25-28.

（收稿日期：2018-12-28 修回日期：2019-02-24）

（編輯：林 靜）