趙飛 譚愛萍 孔璐璐 劉付翠 鄧玉婷 潘厚軍 張瑞泉 姜蘭

摘要：【目的】明確草魚Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路基因在防御多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）感染過程中的免疫作用，為有效防控魚類多子小瓜蟲感染提供理論參考?！痉椒ā恳远嘧有」舷x感染草魚后，采用實時熒光定量PCR檢測分析在不同時間點（感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d）草魚部分TLRs基因（TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21）、接頭蛋白基因（MyD88和TRIF）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（IRAK4和IRAK1）及細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和IFN）在其皮膚和脾臟中的表達(dá)動態(tài)變化。【結(jié)果】草魚感染多子小瓜蟲后，TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮膚和脾臟中的表達(dá)主要呈上調(diào)趨勢，TLR4基因在皮膚中主要呈上調(diào)表達(dá)，在脾臟中則主要呈下調(diào)表達(dá);TLR信號通路接頭蛋白基因MyD88和TRIF的表達(dá)變化趨勢明顯不同，其中，MyD88基因的表達(dá)在感染后第1～3 d均呈顯著上調(diào)趨勢（P<0.05，下同），而TRIF基因的表達(dá)在整個試驗過程中絕大多數(shù)時間點與對照組無顯著差異（P>0.05）;IRAK4和IRAK1在皮膚和脾臟中的表達(dá)也主要呈上調(diào)趨勢，但在脾臟中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢;IL-1β和TNF-α在絕大多數(shù)時間點均顯著上調(diào)，但I(xiàn)FN的表達(dá)基本沒有變化?！窘Y(jié)論】草魚TLR信號通路中的部分TLRs基因（TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21）、接頭蛋白基因（MyD88）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（IRAK4和IRAK1）及下游細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）均參與防御多子小瓜蟲感染的免疫反應(yīng)，尤其是在感染早期和中期發(fā)揮關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞： 草魚;多子小瓜蟲;Toll樣受體（TLR）;信號通路;基因表達(dá)

中圖分類號： S941.514? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）09-1885-08

Abstract：【Objective】The immune defense function of some genes in toll-like receptor（TLR） signaling pathway of grass carp（Ctenopharyngodon idella） against Ichthyophthirius multifiliis infection was clarified to provide theoretical reference for the effective prevention and control of I. multifiliis infection on fish. 【Method】After I. multifiliis infection on C. idella， the real-time fluorescent quantitative PCR was employed to examine and analyze the dynamics of gene expression profiles in the skin and spleen of the C. idella at different time points， including 6 h， 12 h， 1 d， 2 d， 3 d， 5 d， and 7 d. These tested genes contained several TLRs genes（TLR1， TLR2， TLR4， TLR9， TLR20， and TLR21）， adaptor proteins genes（MyD88 and TRIF）， signal transducing molecules（IRAK4 and IRAK1）， and cytokines（IL-1β， TNF-α， and IFN）. 【Result】Several TLRs， including TLR1， TLR2， TLR9， TLR20， and TLR21， were up-regulated in the skin and spleen at most time points after I. multifiliis infection. The expression of TLR4 was mostly up-regulated in the skin， but down-regulated in the spleen.The expression trends of two adaptor proteins genes（MyD88 and TRIF） were obviously different. MyD88 expression showed significant up-regulation from day 1 to day 3 after I. multifiliis infection（P<0.05， the same below）， whereas the expression levels of TRIF showed no significant changes at most time points compared with control（P>0.05）. The expressions of both IRAK4 and IRAK1 also were up-regulated in the skin and spleenat most time points. However， the expressions of IRAK4 at day 1 and IRAK1 at 6 h in the spleen were significantly down-regulated after infection， respectively. The expressions of IL-1β and TNF-α were significantly up-regulated at most time points after infection， but the expression of IFN remained substantially unchanged. 【Conclusion】The several genes in TLR signaling pathway of C. idella， including some TLRs genes（TLR1， TLR2， TLR4， TLR9， TLR20， and TLR21）， one adaptor protein gene（MyD88）， two signal transducing molecules（IRAK4 and IRAK1）， and two downstream cytokines （IL-1β and TNF-α）， are widely involved and play crucial roles in the immune defense against I. multifiliis infection， especially in the early and middle stages of the infection.

Key words： Ctenopharyngodon idella; Ichthyophthirius multifiliis; toll-like receptor（TLR）; signaling pathway; gene expression

0 引言

【研究意義】Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）屬于I型跨膜蛋白，是一類重要的模式識別受體，能特異性識別病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），并通過募集接頭蛋白、轉(zhuǎn)導(dǎo)信號及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子等表達(dá)而發(fā)揮免疫防御作用，既是機(jī)體的第一道天然屏障，也是連接先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁（何玉潔和潘建平，2017）。因此，研究TLR信號通路基因在病原感染過程中的表達(dá)動態(tài)，對揭示病原和魚類間的免疫互作機(jī)制及制定有效的防控措施具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】依據(jù)接頭蛋白的不同哺乳動物TLR信號通路可分為髓系分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴型和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF）依賴型（Yuk and Jo，2011）。TLRs在識別相應(yīng)的PAMPs后，除TLR3外，其他TLRs均以MyD88為接頭蛋白，然后招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4（IL-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4）和IRAK1，再將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6），TRAF6與轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1（Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）及其結(jié)合蛋白（TAK1-binding proteins，TABs）TAB1和TAB2組合成復(fù)合物，從而激活下游的NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)免疫因子表達(dá)，最終啟動免疫防御反應(yīng)（Jiménez-Dalmaroni et al.，2016）。其中，TLR2和TLR4識別細(xì)菌的脂肽和脂多糖等;TLR3識別病毒的雙鏈RNA;TLR5識別細(xì)菌的鞭毛蛋白;TLR7和TLR8識別病毒的單鏈RNA;TLR9識別非甲基化的CpG-DNA（Tan and Kagan，2017）。目前，有關(guān)TLRs與寄生蟲感染的相關(guān)性研究仍較少，僅發(fā)現(xiàn)TLR2或TLR4可識別利什曼原蟲（Leishmania major）（Bec-ker et al.，2003）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）（Debierre-Grockiego et al.，2007）和惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）（Zhu et al.，2011）的糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定蛋白;TLR9可識別克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）非甲基化的DNA（Bafica et al.，2006）;TLR11能識別剛地弓形蟲的Profilin-like蛋白（Yaro-vinsky et al.，2005）等。至今，已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)15種TLRs，而從魚類中至少鑒定出20種TLRs（范澤軍等，2015）。針對魚類的研究主要集中在TLRs與細(xì)菌或病毒感染的相關(guān)性方面（Liao et al.，2017）。Li等（2011a，2011b，2012，2016）研究發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）的TLR2、TLR9、TLR21、MyD88及IRAK1等廣泛參與抵御刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）感染的免疫反應(yīng)，表明魚類TLR信號通路基因在防御寄生蟲的感染過程中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）是一種廣泛分布的纖毛類寄生性原蟲，幾乎可感染全部淡水魚類，引起小瓜蟲?。ㄋ追Q白點病），導(dǎo)致魚類死亡或引起細(xì)菌、病毒等繼發(fā)性感染，而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（宋飛彪等，2012;趙飛等，2012）。草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類之一，約占淡水魚總產(chǎn)量的20%，但草魚養(yǎng)殖一直深受小瓜蟲病困擾。早期研究發(fā)現(xiàn)，草魚的TRAF6、TAK1、TAB1和TAB2及斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的TLR1、TLR2、TLR9和TLR21等TLR信號通路基因參與了抵御多子小瓜蟲感染的免疫應(yīng)答（Zhao et al.，2013a，2013b，2014），但草魚TLR信號通路其他基因是否參與并發(fā)揮防御多子小瓜蟲感染作用等機(jī)理尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以多子小瓜蟲感染草魚后通過實時熒光定量PCR檢測分析草魚的部分TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21）、接頭蛋白（MyD88和TRIF）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（IRAK4和IRAK1）及細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和IFN）在其皮膚和脾臟中的表達(dá)動態(tài)變化，明確草魚TLR信號通路基因在防御多子小瓜蟲感染過程中的免疫作用，為有效防控魚類多子小瓜蟲感染提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

草魚購自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場，健康活潑，規(guī)格整齊，體重約50 g/尾，在養(yǎng)殖過程中未感染過多子小瓜蟲。隨機(jī)挑取10尾草魚，鏡檢魚鰓和體表均未發(fā)現(xiàn)多子小瓜蟲或其他寄生蟲。草魚在實驗室內(nèi)的循環(huán)流水養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)2周，氧氣充足，水溫控制在（23±1）℃，每日定時投喂商品飼料2次。多子小瓜蟲從患病草魚上分離獲得，采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室建立的以斑點叉尾鮰為宿主的室內(nèi)傳代系統(tǒng)進(jìn)行保種傳代（Zhao et al.，2013a，2013b，2014）。

1. 2 多子小瓜蟲幼蟲準(zhǔn)備

在多子小瓜蟲傳代過程中將體表已顯現(xiàn)白點的斑點叉尾鮰置于5 L的塑料燒杯中，發(fā)育成熟的包囊將從魚體上自動脫落，分別用孔徑250和75 μm的網(wǎng)篩過濾、收集包囊。將包囊輕輕洗凈后轉(zhuǎn)入1 L的玻璃燒杯中，添加少量無菌水，23 ℃孵化20 h即發(fā)育成幼蟲，再以孔徑40 μm的網(wǎng)篩過濾，得到活體幼蟲濾液。取10份10 μL的幼蟲濾液，顯微鏡下觀察計數(shù)，換算出總濾液中的多子小瓜蟲活體幼蟲數(shù)量，用于后續(xù)的草魚感染試驗。

1. 3 感染試驗

將120尾草魚隨機(jī)平均分成感染組和對照組。感染組的60尾草魚置于60 L的水桶中，按1∶10000的感染劑量加入多子小瓜蟲活體幼蟲進(jìn)行體表感染，感染2 h后將草魚轉(zhuǎn)至250 L的魚缸中。采用相同方法處理對照組的60尾草魚，但不添加多子小瓜蟲幼蟲。于感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d時分別從感染組和對照組隨機(jī)取樣6尾草魚。以滅菌刀片刮去草魚背部中央的鱗片，使用尖頭鑷子剝離1.0 cm×1.5 cm大小的皮膚，輕輕刮除皮膚內(nèi)側(cè)肌肉以得到干凈的背部皮膚，液氮速凍后-70 ℃保存?zhèn)溆?。同時快速采集脾臟凍存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol試劑盒（Invitrogen公司）提取草魚皮膚和脾臟組織的總RNA，以Nanodrop 1000微量紫外分光光度計（Thermo公司）和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。使用RNase-free DNase I（Fermentas公司）去除基因組DNA后，按ReverTra Ace@ Reverse Transcriptase試劑盒（TOYOBO公司）說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)程序：42 ℃ 20 min;99 ℃ 5 min;4 ℃ 5 min。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 目的基因片段克隆及測序分析

采用Beacon Designer 8.0設(shè)計草魚TLR信號通路基因的特異性引物（表1）。以草魚脾臟cDNA為模板進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25.00 μL：cDNA模板1.00 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.00 μL，10×PCR Buffer（Mg2+）2.50 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.00 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用E.Z.N.A? Gel Extraction Kit（OMEGA公司）進(jìn)行目的條帶回收純化，然后TA克隆至pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取100.00 μL菌液凃布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選3個菌落PCR驗證呈陽性的克隆送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。

1. 6 實時熒光定量PCR檢測分析

采用實時熒光定量PCR檢測感染多子小瓜蟲后草魚皮膚和脾臟組織中TLR信號通路基因的表達(dá)動態(tài)，以每個時間點各組織的cDNA為模板、β-action為內(nèi)參基因，在Roche LightCycler480 Real-time PCR Detection System上進(jìn)行定量檢測分析。反應(yīng)體系10.00 μL：cDNA模板0.40 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.40 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5.00 μL，ddH2O 3.80 μL。每個樣品均設(shè)3個重復(fù)。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時采集1次熒光信號。采用2-△△Ct法（Livak and Schmittgen，2001）計算目的基因的相對表達(dá)量，并以SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 感染多子小瓜蟲后草魚TLRs基因表達(dá)的動態(tài)變化

2. 1. 1 TLR1和TLR2基因的表達(dá)動態(tài) 草魚感染多子小瓜蟲后，其皮膚和脾臟的TLR1和TLR2基因表達(dá)主要呈上調(diào)趨勢（表2）。在感染后第12 h，TLR1基因在皮膚中開始顯著上調(diào)表達(dá)（P<0.05，下同），是對照組的3.02倍，至感染后第1和2 d持續(xù)上調(diào)至對照組的5.38和6.31倍;在脾臟中，TLR1基因在感染后第2和3 d時分別上調(diào)2.49和4.69倍，在其他時間點與對照組間無顯著差異（P>0.05，下同）。TLR2與TLR1基因的表達(dá)變化相似，在皮膚中表現(xiàn)為感染后第1～3 d均顯著上調(diào)，于感染后第3 d達(dá)峰值，為對照組的4.35倍;在脾臟中表現(xiàn)為感染后第2和3 d顯著高于對照組，分別是對照組的2.89和5.69倍。

2. 1. 2 TLR4基因的表達(dá)動態(tài) 草魚感染多子小瓜蟲后，TLR4基因在其皮膚和脾臟中的表達(dá)變化趨勢不同（表2）。在皮膚中，TLR4基因在感染后第12 h上調(diào)為對照組的2.82倍，但至感染后第1 d回落到對照組水平，隨后其表達(dá)又逐漸上調(diào)，于感染第3 d達(dá)峰值（4.55倍）。而在脾臟中，TLR4基因在感染后第12 h和第1 d的表達(dá)量顯著下調(diào)，僅為對照組的35%和25%;在其他時間點與對照組間均無顯著差異。

2. 1. 3 TLR9基因的表達(dá)動態(tài) 草魚感染多子小瓜蟲后，其皮膚中的TLR9基因在感染后第2、3和7 d均呈顯著上調(diào)表達(dá)，于感染后第3 d達(dá)峰值（3.35倍）;而在脾臟中，TLR9基因除在感染第1 d顯著上調(diào)2.45倍和感染后第3 d顯著下調(diào)39%外，其他時間點與對照組間均無顯著差異（表2）。

2. 1. 4 TLR20基因的表達(dá)動態(tài) 草魚感染多子小瓜蟲6 h后，其皮膚中的TLR20基因表達(dá)上調(diào)3.55倍，在感染后第12 h有所回落，然后又持續(xù)上調(diào)，于感染后第2 d達(dá)峰值（4.81倍），隨后逐漸恢復(fù)到對照組水平（表2）。在脾臟中，TLR20基因只在感染后第2和3 d顯著上調(diào)，分別是對照組的2.79和3.09倍。

2. 1. 5 TLR21基因的表達(dá)動態(tài) 多子小瓜蟲感染誘導(dǎo)草魚TLR21基因的表達(dá)變化規(guī)律見表2。在皮膚中，TLR21基因的表達(dá)在感染后第6 h（2.55倍）、第2 d（3.61倍）和第5 d（2.52倍）均顯著高于對照組，在其他時間點也呈上調(diào)趨勢，但差異不顯著。在脾臟中，TLR21基因的表達(dá)在感染后第6 h～第1 d呈持續(xù)上調(diào)趨勢，于感染后第1 d達(dá)峰值（3.45倍）;除感染第5 d TLR21基因表達(dá)量僅為對照組的35%外，在其他時間點與對照組的表達(dá)水平基本一致。

2. 2 感染多子小瓜蟲后草魚接頭蛋白基因表達(dá)的動態(tài)變化

草魚感染多子小瓜蟲后，TLR信號通路接頭蛋白基因MyD88和TRIF的表達(dá)變化趨勢明顯不同，其中，MyD88基因的表達(dá)在感染后第1～3 d均呈顯著上調(diào)趨勢，而TRIF基因的表達(dá)在整個試驗過程中絕大多數(shù)時間點與對照組無顯著差異（表3）。在感染后第6 h，皮膚中MyD88基因的表達(dá)略高于對照組，隨后呈顯著上調(diào)趨勢，于感染后第2 d達(dá)峰值（5.81倍），感染后第3 d略有回落（2.25倍），最終恢復(fù)至對照組水平;脾臟中MyD88基因的表達(dá)在感染后第1～3 d均顯著高于對照組。

2. 3 感染多子小瓜蟲后草魚信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)的動態(tài)變化

草魚感染多子小瓜蟲后，皮膚中的IRAK4在感染后第1～3 d呈顯著上調(diào)趨勢，分別是對照組的3.48、2.81和4.25倍，在其他時間點的變化差異不顯著。在脾臟中，IRAK4在感染后第6和12 h的表達(dá)量略高于對照組，但至感染后第1 d僅為對照組的35%，隨后其表達(dá)迅速上調(diào)，至感染后第2和3 d分別為對照組的3.47和2.69倍，而后又下調(diào)恢復(fù)到對照組水平（表3）。IRAK1表達(dá)的動態(tài)變化表現(xiàn)為：皮膚中IRAK1的表達(dá)量在感染后第1、2和5 d顯著高于對照組，分別是對照組的2.48、3.81和4.73倍，其他時間點也略高于對照組，但差異不顯著。脾臟中的IRAK1在感染后第6 h顯著下調(diào)表達(dá)，僅為對照組的31%，但感染后第2和3 d分別顯著上調(diào)至對照組的2.38和3.69倍（表3）。

2. 4 感染多子小瓜蟲后草魚細(xì)胞因子表達(dá)的動態(tài)變化

草魚感染多子小瓜蟲后，其細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IFN的分泌表達(dá)如表3所示。除感染后第6 h和第7 d外，皮膚中IL-1β的表達(dá)均顯著高于對照組，且在感染后第2 d達(dá)峰值（17.81倍）;在脾臟中，IL-1β的表達(dá)量也均高于對照組，其中在感染后第1、2、3和7 d顯著高于對照組，分別是對照組的9.75、8.38、13.69和2.85倍，于感染后第3 d達(dá)峰值。草魚感染多子小瓜蟲后，TNF-α在其皮膚和脾臟中的表達(dá)表現(xiàn)為大多數(shù)時間點顯著高于對照組，且分別在感染后第5 d（14.27倍）和第2 d（13.38倍）出現(xiàn)峰值。與TNF-α不同，草魚感染多子小瓜蟲后IFN的表達(dá)在大多數(shù)時間點無顯著變化，在皮膚和脾臟中的表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在感染后第2 d（2.64倍）和第3 d（2.38倍）。

3 討論

哺乳動物的TLR2與TLR1通過形成異源二聚體而行使功能，可識別多種寄生蟲的GPI錨定蛋白（Zhu et al.，2011），而多子小瓜蟲體表纖毛上含有豐富的GPI錨定蛋白（Clark et al.，2001）。至今，關(guān)于魚類TLRs抵御寄生蟲感染的機(jī)理研究鮮見報道。本研究通過分析草魚感染多子小瓜蟲后TLR信號通路基因表達(dá)的動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多子小瓜蟲感染能誘導(dǎo)部分TLRs基因（TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21）、接頭蛋白基因（MyD88）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（IRAK4和IRAK1）及細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）的表達(dá)，推測草魚TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21可識別多子小瓜蟲的某些成分，激活TLR信號通路而發(fā)揮免疫防御作用。草魚感染多子小瓜蟲后，TLR1和TLR2基因的表達(dá)動態(tài)變化基本一致，主要為上調(diào)表達(dá)，與多子小瓜蟲感染斑點叉尾鮰（Zhao et al.，2013a）的結(jié)果相似，推測草魚TLR2與TLR1形成二聚體而識別多子小瓜蟲的GPI錨定蛋白。在哺乳動物的相關(guān)研究中，克氏錐蟲和剛地弓形蟲的GPI錨定蛋白可啟動小鼠TLR4信號通路，并證實TLR4基因缺失型小鼠更易感染寄生蟲（Oliveira et al.，2004;Debierre-Grockiego et al.，2007）。目前，主要在斑馬魚和草魚等一些鯉科魚類中鑒定獲得TLR4，而大部分魚類缺失TLR4（Huang et al.，2012）。Sepulcre等（2009）、Sullivan等（2009）研究表明，斑馬魚TLR4無法識別哺乳動物TLR4的配體LPS，即魚類和哺乳類動物的TLR4功能存在差異。本研究結(jié)果表明，多子小瓜蟲感染能誘導(dǎo)草魚皮膚中的TLR4基因上調(diào)表達(dá)（感染第7 d除外），與Zhao等（2013a）研究發(fā)現(xiàn)多子小瓜蟲感染斑點叉尾鮰后TLR4基因表達(dá)并未發(fā)生明顯變化的結(jié)論不同，說明不同魚類的TLR4功能可能也存在一定差異。

禽類TLR21與哺乳動物TLR9的功能相似，均能識別細(xì)菌或寄生蟲的非甲基化DNA（Bafica et al.，2006;Brownlie et al.，2009;Hkima et al.，2009）。哺乳動物缺少TLR21，禽類缺少TLR9，但TLR9和TLR21共存于魚類中。本研究結(jié)果表明，多子小瓜蟲感染致使草魚TLR9和TLR21基因在皮膚中上調(diào)表達(dá)，與刺激隱核蟲感染石斑魚后的結(jié)果（Li et al.，2012）相似，因此推測魚類TLR9和TLR21與哺乳動物TLR9的功能相似。TLR20是魚類特有的TLR，在草魚、斑馬魚、鯉和斑點叉尾鮰等魚類已有相關(guān)報道，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果顯示，魚類TLR20與小鼠TLR11的親緣關(guān)系較近，根據(jù)小鼠TLR11能識別剛地弓形蟲Profilin-like分子的結(jié)論（Yarovinsky et al.，2005），可推測魚類TLR20具有識別原生動物寄生蟲成分的功能作用（Pietretti et al.，2014）。

在哺乳動物中，除TLR3外，其他所有TLRs均可利用MyD88作為接頭蛋白，即MyD88在一定程度上能反映TLRs的整體變化。由于寄生蟲成分復(fù)雜，其宿主中可能存在多個TLRs同時發(fā)揮作用，識別相同或不同的寄生蟲分子，如TLR2和TLR9分別識別克氏錐蟲的GPI和DNA（Bafica et al.，2006），TLR2和TLR4可同時識別剛地弓形蟲的GPI錨定蛋白（Debierre-Grockiego et al.，2007）。相對于單一的TLRs基因缺失，MyD88基因缺失對寄生蟲的感染更敏感（Campos et al.，2004）。草魚感染多子小瓜蟲后，MyD88基因的表達(dá)在感染后第1～3 d均呈顯著上調(diào)趨勢，暗示多子小瓜蟲感染激活了一種或多種TLRs。多子小瓜蟲感染并未引起草魚TRIF基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其原因是TRIF為TLR3的接頭蛋白，而TLR3主要識別病毒RNA分子（Jiménez-Dalmaroni et al.，2016）。

IRAK4和IRAK1是TLRs信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。IRAK4缺失導(dǎo)致小鼠對夏氏瘧原蟲（Plasmodium chabaudi）更易感（Finney et al.，2010）;經(jīng)刺激隱核蟲感染后斜帶石斑魚IRAK4和IRAK1在感染位點和免疫器官中主要呈顯著上調(diào)趨勢，極少數(shù)時間點呈下調(diào)表達(dá)（Li et al.，2014，2016）。在本研究中，受多子小瓜蟲感染后，草魚IRAK4和IRAK1在皮膚和脾臟中的表達(dá)主要呈上調(diào)趨勢，但在脾臟中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢，提示IRAK4和IRAK1可能參與了魚類防御寄生蟲感染的免疫應(yīng)答，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。

TLRs在識別PAMPs后，可激發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)，最終對病原刺激作出響應(yīng)。IL-1β、TNF-α、IFN是TLRs信號通路下游的3種重要細(xì)胞因子。IL-1β、TNF-α和IFN能廣泛參與防御剛地弓形蟲（Kalantari et al.，2016）、克氏錐蟲（Guimar?es-Pinto et al.，2018）等寄生蟲感染免疫反應(yīng);IL-1β和TNF-α可參與多種魚類寄生蟲感染的防御反應(yīng)（Zhi et al.，2018;Zhou et al.，2018）。在本研究中，草魚感染多子小瓜蟲后IL-1β和TNF-α在絕大多數(shù)時間點均顯著上調(diào)，與刺激隱核蟲感染誘導(dǎo)石斑魚的結(jié)果（Li et al.，2011a）相似;但多子小瓜蟲感染后草魚IFN的表達(dá)基本沒有變化，推測IFN并未參與抵御寄生蟲感染的免疫反應(yīng)。

4 結(jié)論

草魚TLR信號通路中的部分TLRs基因（TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21）、接頭蛋白基因（MyD88）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（IRAK4和IRAK1）及下游細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）均參與防御多子小瓜蟲感染的免疫反應(yīng)，尤其是在感染早期和中期發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）