劉婷婷 邢青斌 唐艷斌 陳璐 孫靜 黃建 霍軍生

摘?要：目的：對乳粉中氨基酸分析的水解方法進行研究，比較牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中氨基酸的含量。方法：樣品用含巰基乙酸的鹽酸溶液水解提取，經(jīng)定容、過濾、真空濃縮、復(fù)溶、過膜后，用氨基酸分析儀測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果：應(yīng)用含0.05%巰基乙酸的鹽酸水解液對奶粉樣品進行水解的同時有效防止了蛋氨酸的氧化，相對氧化水解方法節(jié)省前處理時間，方法的回收率為94%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%。通過對牛乳基和羊乳基奶粉樣品中的16種氨基酸分析，牛乳基奶粉中賴氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他相應(yīng)氨基酸含量不存在顯著性差異。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確快速、重現(xiàn)性好，適用于奶粉中氨基酸含量分析的檢測要求。

關(guān)鍵詞：氨基酸;奶粉;牛乳基;羊乳基;氨基酸分析儀

近些年，羊乳基粉和牛乳基粉營養(yǎng)組成及營養(yǎng)價值受到較多關(guān)注，但作為主要乳營養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)的氨基酸，在我國市場上羊乳基粉和牛乳基粉產(chǎn)品中的比較研究尚未見報道。氨基酸主要以結(jié)合態(tài)氨基酸和游離氨基酸形式存在。游離氨基酸可直接取樣提取后檢測，結(jié)合態(tài)氨基酸需將蛋白水解后進行測定。國內(nèi)外學(xué)者對其進行大量研究，由于大部分氨基酸無熒光發(fā)射和紫外吸收特性，需通過衍生后進行檢測[1]，研究人員開發(fā)出柱前衍生的陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法[2]、高效液相色譜法[3-6]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]等，上述方法所需前處理步驟復(fù)雜，分析時間較長，重現(xiàn)性不是很穩(wěn)定，且消耗人力、物力較大。近些年，氨基酸分析儀被廣泛應(yīng)用于氨基酸分析，低pH條件下帶正電荷的各種氨基酸在陽離子交換樹脂上被吸附，隨著不同離子強度、pH值的流動相依次洗脫下來，分離純化后用茚三酮衍生的色譜法，該方法靈敏、快速、重現(xiàn)性好，數(shù)據(jù)可靠。

本研究對乳基粉中氨基酸測定的前處理過程進行優(yōu)化，使用氨基酸分析儀進行分析，建立了快速、準(zhǔn)確、可靠的16種氨基酸含量測定方法。通過分析不同牛乳基奶粉和羊乳基奶粉產(chǎn)品中氨基酸的成分和含量，得到其特征圖譜，為今后評價原材料和相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)良性、真實性提供參考。

1?材料與方法

1.1?樣品和試劑

奶粉樣品：分別采購自四川、內(nèi)蒙、新疆、寧夏、青海、甘肅、重慶、廣西、貴州、云南的商場和超市。涉及嬰幼兒配方奶粉、孕婦奶粉、中老年奶粉，去除調(diào)制乳和乳基不明確的乳粉，篩選出70份牛乳基奶粉和18份羊乳基奶粉樣本。

氨基酸標(biāo)樣，日本W(wǎng)ako公司;質(zhì)控品（SRM 1849A嬰兒/成人營養(yǎng)配方），美國NIST;鹽酸（優(yōu)級純），天津試劑公司;巰基乙酸，美國Sigma公司;氨基酸分析儀配套的流動相（茚三酮溶液和緩沖液），日本W(wǎng)ako公司;實驗用水為MilliQ純水儀制的。

1.2?儀器和設(shè)備

L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司;電熱恒溫干燥箱，上海森信;濃縮儀，東京理化公司;氮吹儀，美國Organomation公司。

1.3?方法

1.3.1?蛋白質(zhì)含量的測定?參照國標(biāo)方法（GB 5009.5—2016）[10]，稱取約0.20g樣品，同時做樣品空白管，每管分別加入5.0mL濃硫酸和催化片（K2SO4 1.5g;Se 0.007 5g），過夜，次日，置消化器消化6h，待消化完全后用凱式自動定氮分析儀測定氮含量，計算得到其蛋白質(zhì)含量。

1.3.2?氨基酸的測定?參照國標(biāo)方法（GB 5009.124—2016）[11]原理測定16種氨基酸，并對樣品預(yù)處理做出調(diào)整。稱取奶粉樣品約0.10g于酸水解管中，在水解管內(nèi)加10mL 6mol/L鹽酸（含0.05%巰基乙酸），充入高純氮氣后封口，將已封口的水解管放入110℃的恒溫鼓風(fēng)箱中，水解22h后取出冷卻。將水解管內(nèi)全部液體轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶內(nèi)，多次沖洗水解管，用去離子水定容。將定容水解液過濾后，吸取1mL于10mL濃縮管中，應(yīng)用真空濃縮儀，在55℃水浴中濃縮，殘留物用1mL水溶解后濃縮至干，用2.0mL 0.02moL/L鹽酸復(fù)溶，過濾后供儀器測定。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用0.02mol/L稀鹽酸稀釋配制得到0.10μmol/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

色譜條件：色譜柱：水解氨基酸色譜柱（4.6mm×60mm，3μm）;檢測波長：570、440nm;反應(yīng)柱溫度：135℃;分析柱溫度：57℃;進樣體積：20μL;洗脫溶液流速：0.4mL/min;柱后衍生試劑流速：0.35mL/min。

1.3.3?數(shù)據(jù)分析?用外標(biāo)法分別測定篩選出的70份牛乳基樣本和18份羊乳基樣本中16種氨基酸的含量，應(yīng)用SRM 1849A嬰兒/成人營養(yǎng)配方粉作為質(zhì)控驗證分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，通過SAS 9.4軟件，用中位數(shù)[四分位間距（quartile，QR）]表示，采用Wilcoxon秩和檢驗比較組間差異。

2?結(jié)果與分析

2.1?氨基酸測定方法的改進

2.1.1?色譜分離效果?使用氨基酸分析儀，采用陽離子色譜柱分離后茚三酮在線衍生的方法，該方法靈敏準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。從圖1～2可以看出，基線平穩(wěn)，色譜峰窄而尖，分析時間短，分離效果好。在實際奶粉樣品中，目標(biāo)峰也與其他雜質(zhì)峰分離良好。

2.1.2?檢出限及定量限?在上述分析條件下，結(jié)合稱樣量，前處理過程和復(fù)溶后的定容體積，以3倍信噪比計算方法檢出限（LOD），10倍信噪比計算方法定量限（LOQ）（表1）。

2.1.3?分析條件優(yōu)化及準(zhǔn)確性評估?蛋氨酸作為含硫氨基酸，在酸水解過程中，容易被氧化而導(dǎo)致測定值比實際含量值偏低，因此，蛋氨酸回收率的提高是保證酸水解氨基酸檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵。為此，本研究采用3種不同的前處理水解液對樣品進行回收率試驗，并比較了上機前氮氣濃縮和真空濃縮的效果（表2）。在樣品前處理過程中，加入含0.05%巰基乙酸的鹽酸水解法對樣品中蛋氨酸的水解保護效果較好。因巰基乙酸具有巰基和羥酸的反應(yīng)特征，直接對蛋白類樣品進行水解的同時，還可有效防止蛋氨酸被氧化，減少了氨基酸前處理過程中的氧化損失。加入巰基乙酸的鹽酸水解液法相對氧化保護后酸水解法分析步驟相對簡單，節(jié)省前處理時間，回收率達(dá)到94%～97%，高于原國標(biāo)方法采用的方法（回收率 89%～93%），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.0%，真空濃縮儀趕酸富集過程樣品中的氨基酸更穩(wěn)定，不易被空氣氧化，重現(xiàn)性好，表明此方法有較好的重復(fù)性，準(zhǔn)確可靠。

2.2?奶基中氨基酸比較

應(yīng)用氨基酸分析儀對來自牛乳基和羊乳基樣品中的16種氨基酸進行分析，NIST的嬰兒/成人營養(yǎng)配方粉1849A作為質(zhì)控品，對蛋白質(zhì)和相應(yīng)的氨基酸進行質(zhì)量控制，試驗所得的質(zhì)控品氨基酸含量在靶值范圍內(nèi)。各氨基酸含量總和基本等于其蛋白質(zhì)的含量，也間接證明了本方法測定乳粉中氨基酸含量的準(zhǔn)確性。根據(jù)對70份牛乳基奶粉和18份羊乳基樣本的分析，蛋白質(zhì)含量平均為15%（11%～22%）。牛奶基和羊奶基奶粉中均含有豐富的氨基酸，種類齊全，包括絲氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等（表3）。

3?結(jié)論

本研究通過對乳基奶粉中氨基酸分析的前處理條件進行優(yōu)化研究，在鹽酸水解液中加入巰基乙酸對含硫的蛋氨酸進行保護，相比傳統(tǒng)酸水解方法減少氧化損失，其分析步驟相對簡單，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，為進一步開展奶粉氨基酸成分及含量的相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。通過氨基酸分析儀對國內(nèi)市場上銷售的牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中16種氨基酸進行測定，發(fā)現(xiàn)牛乳基奶粉中酪氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他種類的氨基酸含量在牛乳基和羊乳基奶粉中不存在顯著性差異，為今后相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評價提供參考。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）