黎銘 馬春霞 黎建斌 雷愛(ài)瑩 李莉萍 李大列 陳福艷 陳明

黎銘（1980-），博士，副研究員，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究工作。主持完成siRNA感染抗對(duì)蝦白斑病毒研究、雞卵黃抗體抗對(duì)蝦白斑病毒研究等8項(xiàng)省部級(jí)項(xiàng)目，參與完成國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“白斑綜合癥病毒編碼的microRNA在病毒感染凡納濱對(duì)蝦過(guò)程中的作用”、廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目“香港牡蠣三倍體養(yǎng)殖性狀評(píng)估分析災(zāi)后恢復(fù)”等18項(xiàng)。現(xiàn)主持、參與國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目等13項(xiàng)。獲廣西科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，水產(chǎn)新品種1項(xiàng)。在國(guó)內(nèi)外期刊上發(fā)表論文40余篇，其中SCI一區(qū)10篇，中文核心期刊25篇。申報(bào)國(guó)家專(zhuān)利8項(xiàng)，獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利6項(xiàng)。研發(fā)的對(duì)蝦抗菌肽已轉(zhuǎn)企業(yè)生產(chǎn)，社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益顯著。

摘要：【目的】分析無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)腸道菌群的影響，為揭示無(wú)乳鏈球菌與腸道菌群的相互作用機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳詿o(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株的菌懸液經(jīng)口灌胃吉富羅非魚(yú)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析無(wú)乳鏈球菌在羅非魚(yú)腸道中的定植情況及對(duì)羅非魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響?！窘Y(jié)果】口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液的羅非魚(yú)在24 h后出現(xiàn)鏈球菌病的典型癥狀，至口服后第3 d試驗(yàn)組羅非魚(yú)全部死亡;口服12 h后羅非魚(yú)腸道內(nèi)的無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株數(shù)量達(dá)峰值，但口服24 h后其數(shù)量顯著下降（P<0.05）。口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液后羅非魚(yú)腸道樣品OTUs的數(shù)量和種類(lèi)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為口服12 h后引起羅非魚(yú)腸道菌群多樣性明顯降低，但口服24 h后出現(xiàn)反彈并高于初始水平，且腸道菌群多樣性與無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株在腸道中的含量呈明顯負(fù)相關(guān)?？诜o(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液引起羅非魚(yú)腸道菌群構(gòu)成比例發(fā)生明顯變化，門(mén)水平上排名前10位的變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、廣古菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)和軟壁菌門(mén)細(xì)菌所占比例上升，厚壁菌門(mén)、梭菌門(mén)、放線菌門(mén)、奇古菌門(mén)和螺旋體門(mén)所占比例則呈下降趨勢(shì);在屬水平上表現(xiàn)為羅非魚(yú)腸道菌群排名前10位的優(yōu)勢(shì)菌屬除了擬桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬呈上升趨勢(shì)外，其他菌屬如鯨桿菌屬、乳球菌屬和丙酸菌屬等均呈下降趨勢(shì)，即羅非魚(yú)大部分腸道優(yōu)勢(shì)菌群已受到無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株的抑制?！窘Y(jié)論】無(wú)乳鏈球菌感染羅非魚(yú)后腸道菌群構(gòu)成及其多樣性明顯改變，可引起致病菌愛(ài)德華氏菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌比例的增加，同時(shí)引起鯨桿菌屬、丙酸菌屬和乳球菌屬等腸道有益細(xì)菌比例的減少，故推測(cè)遲緩愛(ài)德華氏菌和熒光假單胞菌繼發(fā)感染在羅非魚(yú)鏈球菌病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

關(guān)鍵詞： 羅非魚(yú);無(wú)乳鏈球菌;腸道細(xì)菌;菌群構(gòu)成;多樣性;16S rRNA高通量測(cè)序

中圖分類(lèi)號(hào)： S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）08-1647-10

Effects of Streptococcus agalactiae on intestinal flora of tilapia

LI Ming1， MA Chun-xia2， LI Jian-bin1， LEI Ai-ying1， LI Li-ping1，LI Da-lie1，

CHEN Fu-yan1*， CHEN Ming1*

（1Guangxi Institute of Fisheries/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning 530021， China; 2Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】This study analyzed the influence of Streptococcus agalactiae on the intestinal flora of tilapia to provide reference for revealing the interaction mechanism between S. agalactiae and intestinal flora. 【Method】Experimental Tilapia mossambica were fed with bacterial suspension of S. agalactiae virulent strain HN016， and then real-time fluorescence quantitative PCR was used to analysis the amount of HN016 in gut and 16S rRNA high-throughput sequen-cing method was used to analyze the changes on structure and diversity of tilapia intestinal flora. 【Result】The results showed that the tilapia administrated with bacterial suspension of S. agalactiae virulent strain HN016 presented typical symptoms of streptococcal disease after 24 h， and all the tilapia in the positive group died on day 3 after oral administration. The amount of S. agalactiae virulent strain HN016 reached its peak in the intestinal tract after 12 h of oral administration and significantly decreased after 24 h（P<0.05）. Great changes on the OTUs number and species of the intestinal sample were showed after oral administration. The intestinal flora diversity of tilapia decreased after 12 h of oral administration of HN016， but the diversity rebounded and was higher than the initial level after 24 h. The diversity of intestinal flora of tilapia was negatively correlated with the content of S. agalactiae virulent strain HN016 in the intestinal tract. Oral administration of HN016 caused obvious changes in the composition of intestinal flora of tilapia. The composition of intestinal flora in the top 10 was analyzed and found that the proportion of Proteobacteria， Bacteroidetes， Euryarchaeota， Synergistetes， Tenericutes increased obviously，and the proportion of Firmicutes， Fusobacteria， Actinobacteria， Thaumarchaeota， Spirochaetes decreased observably. On genus level， among the top 10 dominant bacteria in tilapia intestine， except for the proportion of Edwardsiella， Pseudomonas increased， the proportion of other bacteria such as Cetobacterium， Lactococcus and Propionibacterium decreased. It indicated that most dominant intestinal flora were inhibited by S.agalactiae virulent strain HN016. 【Conclusion】Oral administration of S. agalactiae HN016 strains results in changes in intestinal flora composition and diversity of tilapia， it also increases the proportions of Edwardsiella， Pseudomonas， and decreases the proportions of intestinal beneficial bacteria such as Cetobacterium， Propionibacterium and Lactococcus. Therefore， it is inferred that E. tarda and P. fluorescens secondary infection plays an important role in tilapia S. agalactiae.

Key words： tilapia; Streptococcus agalactiae; intestinal bacteria; flora composition; diversity; high throughput sequencing of 16S rRNA

0 引言

【研究意義】羅非魚(yú)肉厚刺少、質(zhì)嫩味美，且兼具生長(zhǎng)快、病害少、適應(yīng)力強(qiáng)的特點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為全球廣泛養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)品種（林虹等，2013）。我國(guó)是全球最大的羅非魚(yú)養(yǎng)殖和加工出口國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)量達(dá)178萬(wàn)t，出口量達(dá)39萬(wàn)t。鏈球菌（Streptococcus）嚴(yán)重制約著羅非魚(yú)的健康養(yǎng)殖，其累積死亡率可達(dá)30%～80%（李莉萍等，2015）。自2009年以來(lái)，我國(guó)多個(gè)地區(qū)暴發(fā)羅非魚(yú)鏈球菌病，且呈全國(guó)蔓延趨勢(shì)，給羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，鏈球菌病已成為水產(chǎn)病害防控的重點(diǎn)對(duì)象（盧邁新，2010）。由于鏈球菌可在羅非魚(yú)腸道潛伏感染，在特定條件下能大量繁殖而促使鏈球菌病暴發(fā)，因此，研究鏈球菌在羅非魚(yú)腸道內(nèi)的定植、繁殖及其與腸道屏障和機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用規(guī)律，對(duì)有效防控羅非魚(yú)鏈球菌病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】相關(guān)數(shù)據(jù)表明，90%以上羅非魚(yú)鏈球菌病臨床菌株為無(wú)乳鏈球菌（S. agalactiae）（馮東岳，2010;李莉萍等，2015）。無(wú)乳鏈球菌的感染與季節(jié)和溫度有關(guān)，熱帶地區(qū)高溫季節(jié)更易導(dǎo)致羅非魚(yú)鏈球菌病的暴發(fā)（林虹等，2013）。無(wú)乳鏈球菌主要通過(guò)胃腸道進(jìn)入機(jī)體，其感染和致病過(guò)程一般可分為在盲腸或小腸內(nèi)定植→小腸上皮細(xì)胞穿越→宿主免疫防御逃避3個(gè)階段（黎源等，2017）。此外，無(wú)乳鏈球菌能在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并增殖，借以突破血腦屏障，進(jìn)入血液和中央神經(jīng)系統(tǒng)，然后快速擴(kuò)散至其他器官組織（祝璟琳等，2013，2014）。目前，抗生素仍是魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病防治最有效的方法，但生產(chǎn)環(huán)節(jié)中過(guò)量使用抗生素極易導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生、食品質(zhì)量安全及生態(tài)環(huán)境污染等一系列問(wèn)題（程世亮等，2016）。據(jù)報(bào)道，2009年前使用抗生素還可有效控制部分鏈球菌病的病情，但自2010年之后抗生素對(duì)鏈球菌幾乎不產(chǎn)生實(shí)際效果（李莉萍等，2013）。袁偉（2017）研究表明，我國(guó)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物和磺胺類(lèi)藥物的耐藥率均超過(guò)85.0%，對(duì)諾氟沙星的耐藥率為14.2%，對(duì)洛美沙星的耐藥率為82.8%，對(duì)依諾沙星的耐藥率高達(dá)98.2%。黃艷華等（2018）研究表明，廣西羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌的耐藥譜型呈多樣性，譜型豐富度較高，且因來(lái)源地不同和年際變化存在一定差異性。梁靜真等（2018）研究表明，廣西羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌存在tetM +tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS-兩種耐藥基因型，攜帶tetM基因羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌經(jīng)體外誘導(dǎo)后對(duì)多西環(huán)素的耐藥性大幅度提高。【本研究切入點(diǎn)】腸道細(xì)菌依賴(lài)宿主自身營(yíng)養(yǎng)或分解腸道食物團(tuán)而賴(lài)以生存，同時(shí)其代謝合成的維生素及胞外酶產(chǎn)物可被宿主利用，因此在宿主的營(yíng)養(yǎng)消化吸收方面發(fā)揮著重要作用（Nayak，2010）;此外，腸道常在菌群對(duì)病原菌定居和增殖起屏障作用，在一定程度上可保護(hù)宿主免受病原菌侵害（Thursby and Juge，2017）。雖然腸道菌群屏障對(duì)病原菌具有排斥作用，但仍有不少病原菌能順利穿越腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和普及應(yīng)用，使得腸道菌群的研究變得越來(lái)越方便，也為揭示病原菌與腸道菌群的相互作用機(jī)制提供了有利條件?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】鑒于無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)危害的嚴(yán)重性，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及高通量測(cè)序技術(shù)等分析無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)腸道菌群的影響，以期為揭示無(wú)乳鏈球菌與腸道菌群的相互作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試吉富羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）來(lái)自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院國(guó)家級(jí)羅非魚(yú)良種場(chǎng)，其平均體重30.15±2.60 g/尾。經(jīng)腦組織和腎臟分離細(xì)菌，確認(rèn)無(wú)細(xì)菌感染。羅非魚(yú)暫養(yǎng)于800 L的養(yǎng)殖容器中，（30±4）℃下養(yǎng)2周。羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株由廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1. 2 特異性引物和探針

根據(jù)無(wú)乳鏈球菌保守基因cfb（GenBank登錄號(hào)3686873）設(shè)計(jì)特異性引物cfb-F/cfb-R及探針cfb-P probe（表1），擴(kuò)增長(zhǎng)度113 bp。以上引物及探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 羅非魚(yú)口服無(wú)乳鏈球菌

試驗(yàn)羅非魚(yú)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3個(gè)養(yǎng)殖容器（3個(gè)重復(fù)），每個(gè)容器35尾。使用灌胃器給試驗(yàn)組羅非魚(yú)經(jīng)口灌胃（口服）無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液，1.5×109 CFU/尾，對(duì)照組口服等量無(wú)菌PBS溶液。口服后觀察和統(tǒng)計(jì)羅非魚(yú)死亡情況，并在口服后12 h、24 h和3 d、7 d、15 d分別從每個(gè)養(yǎng)殖容器中隨機(jī)挑選5尾羅非魚(yú)用于腸道菌群檢測(cè)。在無(wú)菌條件下采集被挑選羅非魚(yú)的全腸樣品，用鑷子擠壓方法清除腸道內(nèi)容物，然后以無(wú)菌生理鹽水沖洗腸道3遍。清理后的腸道按十二指腸、前腸、后腸和直腸剪斷后，分類(lèi)保存于-80 ℃冰箱備用。取出羅非魚(yú)腸道樣品快速置于液氮預(yù)冷的研缽中，研磨成粉末狀，再加入溶菌酶溶液進(jìn)行處理，然后按組織DNA抽提試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]說(shuō)明進(jìn)行DNA抽提，所得DNA以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度，用于16S rRNA序列高通量測(cè)序分析及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌在羅非魚(yú)腸道中的定植情況

參照王瑞等（2015）的研究方法，對(duì)無(wú)乳鏈球菌DNA樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e獲得濃度相當(dāng)于108～101個(gè)/mL的8個(gè)梯度無(wú)乳鏈球菌DNA樣品，然后測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的最低模板濃度并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照 Real Time PCR/TaqMan檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50.0 μL： DNA模板4.0 μL，cfb-F/cfb-R各1.0 μL，TaqMan探針（cfb-P probe）2.0 μL，Premix Ex Taq 25.0 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL，滅菌蒸餾水16.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣，每次試驗(yàn)均包括空白對(duì)照（DNA模板用ddH2O代替）。PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因股份有限公司測(cè)序。參照王瑞等（2015）的研究方法，根據(jù)擴(kuò)增Ct值計(jì)算無(wú)乳鏈球菌數(shù)量，并采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1. 5 基于16S rRNA序列分析口服無(wú)乳鏈球菌前后羅非魚(yú)腸道菌群變化

取適量DNA樣品用無(wú)菌水稀釋至1.0 ng/μL。以稀釋DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域（16S rRNA的V3～V4區(qū)）選擇，使用帶Barcode的特異引物及高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以2.0%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè);參照TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒說(shuō)明構(gòu)建文庫(kù)，所得文庫(kù)經(jīng)Qubit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)拆分后，對(duì)獲得的Tags進(jìn)行過(guò)濾、去嵌合體序列，最后獲得Effective Tags。采用Uparse v7.0.1001（http：//drive5.com/uparse/）對(duì)全部Effective Tags進(jìn)行聚類(lèi)，按照97%的序列相似性將Effective Tags聚類(lèi)成OTUs（Operational taxonomic units），篩選出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列。利用GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）和RDP Classifier v2.2（http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)ㄩ撝禐?.8～1.0），并分別從界（Kingdom）、門(mén)（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）和種（Species）分類(lèi)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)均一化處理后進(jìn)行多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 無(wú)乳鏈球菌在羅非魚(yú)腸道的定植分布情況

口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液的羅非魚(yú)在24 h后出現(xiàn)鏈球菌病的典型癥狀：精神不振，游姿異常，體色發(fā)黑;至口服后第3 d試驗(yàn)組羅非魚(yú)全部死亡，而對(duì)照組羅非魚(yú)在整個(gè)試驗(yàn)周期均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)口服0～24 h后羅非魚(yú)腸道內(nèi)的無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株數(shù)量，結(jié)果（圖1）表明，口服12 h后羅非魚(yú)腸道內(nèi)的無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株數(shù)量達(dá)峰值，但口服24 h后其數(shù)量顯著下降（P<0.05）。

2. 2 16S rRNA測(cè)序分析結(jié)果

通過(guò)HiSeq2500 PE250對(duì)12個(gè)羅非魚(yú)腸道樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果共獲有效Tags數(shù)量為67067條，獲得注釋的Tags數(shù)量為65236條。每個(gè)樣品有效Tags數(shù)量為50992～67067條（圖2），平均長(zhǎng)度為405～426 nt。利用Uparse v7.0.1001對(duì)樣品的有效Tags序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，按照97%的序列相似性將這些序列聚類(lèi)成OTUs，類(lèi)聚和注釋結(jié)果表明，12個(gè)羅非魚(yú)腸道樣品OUTs數(shù)量介于510～984個(gè)，平均為753個(gè)（圖2）。

為了檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的合理性，對(duì)16S rRNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行物種累積箱形圖分析，結(jié)果顯示，隨著羅非魚(yú)腸道樣本量的增加，箱形圖位置趨于平緩（圖3），表明12個(gè)腸道樣品測(cè)序結(jié)果已包含羅非魚(yú)腸道絕大部分腸道菌群物種，即抽樣充分。

2. 3 正常羅非魚(yú)腸道各部位優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)成比例

對(duì)口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液前（0 h）羅非魚(yú)腸道菌群測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）表明，在屬水平上正常羅非魚(yú)腸道排名前10位的菌屬分別為鯨桿菌屬（Cetobacterium，占15.3%）、乳球菌屬（Lactococcus，占5.6%）、Romboutsia（占7.9%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，5.2%）、地桿菌屬（Pedobacter，1.2%）、普氏菌屬（Prevotella_9，占1.0%）、擬桿菌屬（Bacteroides，1.0%）、Candidatus_Nitrosopumilus（占0.7%）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus，占0.7%）和嗜肽菌屬（Peptoniphilus，占0.6%），其他菌屬占60.5%。

2. 4 口服無(wú)乳鏈球菌后羅非魚(yú)腸道菌群多樣性的變化

為檢驗(yàn)口服無(wú)乳鏈球菌是否會(huì)導(dǎo)致羅非魚(yú)腸道菌群變化，對(duì)不同時(shí)間段羅非魚(yú)腸道菌群進(jìn)行比較分析。韋恩圖分析結(jié)果（圖5-A）表明，與口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液前（0 h）相比，口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液12和24 h后羅非魚(yú)腸道樣品的OTUs數(shù)量和種類(lèi)發(fā)生明顯變化，口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液前（0 h）羅非魚(yú)腸道樣品特有OTUs為313個(gè)，口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液12 h的特有OTUs為330個(gè)，口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液24 h的特有OTUs為542個(gè)。測(cè)序結(jié)果中OTUs數(shù)量即代表物種的數(shù)量。稀釋曲線（圖5-B）顯示，口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液12 h后羅非魚(yú)腸道樣品菌群多樣性降低，但24 h后其多樣性呈上升狀態(tài)，且高于口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液前的初始水平。Shannon指數(shù)（圖5-C）和Simpson指數(shù)（圖5-D）與稀釋曲線結(jié)果一致，口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液12 h后羅非魚(yú)腸道樣品菌群多樣性降低，但24 h后多樣性呈上升趨勢(shì)。

2. 5 口服無(wú)乳鏈球菌后羅非魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

為檢驗(yàn)組間差異是否顯著大于組內(nèi)差異，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組羅非魚(yú)腸道菌群構(gòu)成進(jìn)行單因素相似性（ANOSIM）分析，結(jié)果表明，各組間的R值均大于0（圖 6），說(shuō)明各組間羅非魚(yú)腸道菌群構(gòu)成差異顯著，且組間差異大于組內(nèi)差異。

口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液后羅非魚(yú)腸道菌群中排名前10位的菌門(mén)（圖7）分別是變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）、互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、梭菌門(mén)（Fusobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）和螺旋體門(mén)（Spirochaetes），其中變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、廣古菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)和軟壁菌門(mén)的占比呈上升趨勢(shì)，而其他菌門(mén)呈下降趨勢(shì)。

在屬水平上，口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液12 h后可引起羅非魚(yú)腸道菌群中擬桿菌屬（Bacteroides）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Romboutsia、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、愛(ài)德華氏菌屬（Edwardsiella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、臨單胞菌屬（Plesiomonas）和梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）的相對(duì)豐度上升，同時(shí)引起鯨桿菌屬（Cetobacterium）、丙酸菌屬（Propionibacterium）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）、Candidatus_Nitrosopumilus、乳球菌屬（Lactococcus）、地桿菌屬（Pedobacter）、Peptoniphilus、普氏菌屬（Prevotella_9）和Blautia的相對(duì)豐度下降（圖8-A）;口服24 h后主要引起疣微菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、Allobaculum、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae_UCG-005）、vadinBC27_ was-tewater-sludge_group、羅斯氏菌屬（Roseburia）、厭氧棒菌屬（Anaerobaculum）、優(yōu)桿菌屬（[Eubacterium]_coprostanoligenes_group）、unidentified_WCHB1-69、甲烷絲菌屬（Methanosaeta）、疣微菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）和熱桿菌屬（Methanothermobacter）的相對(duì)豐度上升，同時(shí)引起擬桿菌屬（Bacteroides）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Romboutsia、鯨桿菌屬（Cetobacterium）和丙酸菌屬（Propionibacterium）的相對(duì)豐度下降（圖8-B）。

3 討論

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，魚(yú)類(lèi)腸道形成其固有的菌群結(jié)構(gòu)，而這些固有菌群除了參與宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝、輔助消化外，還具有屏障及免疫功能（Gómez and Balcázar，2008;Kelly，2010;Sommer and B?ckhed，2013;Xia et al.，2014）。本研究通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)羅非魚(yú)腸道菌群進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常羅非魚(yú)腸道菌群在屬水平上以鯨桿菌屬、乳球菌屬、Romboutsia、不動(dòng)桿菌屬、地桿菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬、Candidatus_Nitrosopumilus、芽孢乳桿菌屬和嗜肽菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，而其他細(xì)菌占腸道菌群總量的60.5%。在種水平上，正常羅非魚(yú)腸道也含有無(wú)乳鏈球菌（占腸道總菌種數(shù)量的0.32%）。說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌是羅非魚(yú)的條件性致病菌，在正常情況下由于受機(jī)體免疫機(jī)能及其他腸道菌群的制衡而無(wú)法暴發(fā)致病。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道可知，羅非魚(yú)鏈球菌病多流行于高溫季節(jié)，尤其水溫在32 ℃以上時(shí)極易暴發(fā)流行（盧邁新，2010;陳家長(zhǎng)等，2011;鄧永強(qiáng)和汪開(kāi)毓，2016）。在本研究中，羅非魚(yú)在口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液后第3 d全部死亡，說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株對(duì)羅非魚(yú)具有很強(qiáng)的毒力。

雖然魚(yú)類(lèi)腸道固有菌群對(duì)病原微生物起屏障作用，但魚(yú)類(lèi)腸道菌群常因品種、年齡、環(huán)境、食物及疾病等因素的影響而發(fā)生改變（Gómez Balcázar，2008;Roeselers et al.，2010;Sommer and B?ckhed，2013）。在菌群失衡的情況下，某些病原菌得到過(guò)量繁殖，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生，因此研究病原菌與腸道固有菌群的相互作用機(jī)制對(duì)防控條件性致病菌具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)正常羅非魚(yú)經(jīng)口灌胃無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液，發(fā)現(xiàn)口服12 h 后羅非魚(yú)腸道內(nèi)的無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株數(shù)量達(dá)峰值，但口服24 h后其數(shù)量顯著下降，說(shuō)明此時(shí)已有部分口服菌株進(jìn)入機(jī)體其他部位或通過(guò)腸道排除。此外，羅非魚(yú)口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液后，其腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生明顯變化，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及稀釋曲線均顯示口服12 h后羅非魚(yú)腸道菌群多樣性降低，但至口服24 h后菌群多樣性上升且高于初始水平，說(shuō)明此時(shí)羅非魚(yú)腸道菌群已失衡。類(lèi)似案例在其他動(dòng)物也有報(bào)道，如大熊貓感染犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）后其腸道內(nèi)菌群構(gòu)成發(fā)生改變，且微生物多樣性呈升高趨勢(shì)（Zhao et al.，2017）。人類(lèi)的胃腸炎和糖尿病也與腸道細(xì)菌的豐度及多樣性降低有關(guān)（Nishino et al.，2017;Jandhyala et al.，2017）?？梢?jiàn)，菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性改變是腸道菌群失衡的重要標(biāo)志。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，魚(yú)類(lèi)疾病對(duì)其胃腸道菌群的影響越來(lái)越受到關(guān)注。張正等（2015）通過(guò)研究皮膚潰瘍病和腹水病發(fā)生對(duì)半滑舌鰨腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)皮膚潰瘍病的發(fā)生對(duì)半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有影響，但腹水病對(duì)半滑舌鰨腸道的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成及相對(duì)豐度均產(chǎn)生明顯影響。李東亮（2016）研究表明，當(dāng)草魚(yú)受到嗜水氣單胞菌感染時(shí)，其腸道菌群中的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)——厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)所占比例均隨致病菌感染量的升高而降低，梭桿菌門(mén)所占比例則呈上升趨勢(shì);在屬水平上，主要優(yōu)勢(shì)菌屬——芽孢桿菌屬和氣單胞菌屬所占比例隨致病菌感染量的升高而降低，而鯨桿菌屬所占比例呈上升趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，羅非魚(yú)口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液后其腸道菌群中的變形桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、廣古菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)和軟壁菌門(mén)所占比例呈上升趨勢(shì)，而厚壁菌門(mén)、梭菌門(mén)、放線菌門(mén)、奇古菌門(mén)和螺旋體門(mén)呈下降趨勢(shì)。可見(jiàn)，細(xì)菌性疾病對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道菌群的影響作用因病因或品種差異而不同。

口服無(wú)乳鏈球菌HN016菌懸液后羅非腸道菌群的變化還體現(xiàn)在屬水平上，表現(xiàn)為正常羅非魚(yú)腸道菌群排名前10位的優(yōu)勢(shì)菌屬除了擬桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬呈上升之外，其他菌屬如鯨桿菌屬、乳球菌屬和丙酸菌屬等均呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明羅非魚(yú)腸道內(nèi)大部分優(yōu)勢(shì)菌群已受到無(wú)乳鏈球菌HN016強(qiáng)毒株的抑制，但同時(shí)一些病原菌如鏈球菌屬、愛(ài)德華菌屬和假單胞菌屬的構(gòu)成比例呈上升趨勢(shì)。劉志剛等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，感染無(wú)乳鏈球菌尼羅羅非魚(yú)腸道菌群中的鏈球菌屬、分枝桿菌屬和曼氏桿菌屬等致病菌群相對(duì)豐度顯著高于健康尼羅羅非魚(yú)，而乳球菌屬、鯨桿菌屬和紅球菌屬等益生菌相對(duì)豐度顯著低于健康尼羅羅非魚(yú)。說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌的感染能改變魚(yú)類(lèi)腸道優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，引起腸道內(nèi)潛在致病菌數(shù)量的增加。由于遲緩愛(ài)德華氏菌和熒光假單胞菌的感染癥狀與羅非魚(yú)鏈球菌病典型癥狀極為相似，故推測(cè)遲緩愛(ài)德華氏菌和熒光假單胞菌繼發(fā)感染在羅非魚(yú)鏈球菌病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

4 結(jié)論

無(wú)乳鏈球菌感染羅非魚(yú)后腸道菌群構(gòu)成及其多樣性發(fā)生明顯改變，可引起致病菌愛(ài)德華氏菌屬、假單胞菌屬細(xì)菌比例的增加，同時(shí)引起鯨桿菌屬、丙酸菌屬、乳球菌屬等腸道有益細(xì)菌比例的減少，故推測(cè)遲緩愛(ài)德華氏菌和熒光假單胞菌繼發(fā)感染在羅非魚(yú)鏈球菌病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）