李青青 吳疆 鄭碧榮 李儒月 王書賢 朱耀強(qiáng)

摘 要： 紅毛五加屬于五加科植物，而五加科植物大多具有調(diào)節(jié)免疫力的雙向調(diào)節(jié)作用，紅毛五加多糖是從中藥紅毛五加中提取的單一組分，目前關(guān)于紅毛五加多糖的抑炎作用還少有報(bào)道。為了探究紅毛五加多糖AHP-Ⅱ?qū)PS導(dǎo)致的大鼠肝細(xì)胞免疫損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，該研究將實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組（LPS，40 μg·mL-1）和AHP-Ⅱ低、中、高劑量組（25，50，100 μg·mL-1）五組，以LPS（40 μg·mL-1）來制備大鼠肝細(xì)胞免疫損傷模型，先用ELISA方法檢測細(xì)胞分泌TNF-α的水平及流式檢測ROS的含量，來探究AHP-Ⅱ不同劑量對炎癥因子的抑制作用，再用western方法檢測P-JNK2的蛋白水平來進(jìn)一步探究AHP-Ⅱ的抑制作用機(jī)制。結(jié)果表明：低、中、高劑量組的AHP-Ⅱ均可使肝細(xì)胞損傷后的TNF-α含量下降。同時(shí)，AHP-Ⅱ中、高劑量組均可使損傷后的肝細(xì)胞ROS的分泌量下降，且AHP-Ⅱ高劑量組抑制ROS的作用最強(qiáng)。在加入AHP-Ⅱ后，JNK2蛋白的磷酸化水平呈劑量依賴性降低，AHP-Ⅱ高劑量組抑制作用最強(qiáng)。這說明紅毛五加多糖AHP-Ⅱ可以通過降低P-JNK2的蛋白含量來抑制炎癥因子TNF-α及ROS的水平，以發(fā)揮免疫保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞： 紅毛五加多糖， 脂多糖， 肝損傷， JNK

中圖分類號： Q946， R285 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2019）07-0880-07

Abstract： Acanthopanax giraldii belongs to the Araliaceae plant， and most of the Araliaceae plants have a two-way regulation effect in regulating immunity. A. giraldii polysaccharide is a single component extracted from the traditional Chinese medicine A. giraldii. The anti-inflammatory effect of polysaccharides has rarely been reported. This study aimed to explore the protective effect and mechanism of polysaccharide AHP-Ⅱ on LPS-induced hepatocyte injury in rats. This experiment was divided into five groups： blank group， model group （LPS， 40 μg·mL-1）， AHP-Ⅱ low， moderate， high-dose group （25， 50， 100 μg·mL-1）. LPS （40 μg·mL-1） was used to prepare the rat hepatocyte immune injury model. The cytotoxic effect of AHP-Ⅱ on hepatocytes was first examined by CCK-8 method to eliminate interference， and the secreted level of TNF-α by the cells and the level of ROS were measured by ELISA and flow cytometry respectively to establish the hepatocyte immune injury model. Then the inhibitory effect of different doses of AHP-Ⅱ on inflammatory factors was explored， and the level of JNK2 protein and its phosphorylation were detected by western method to further explore the inhibitory mechanism of AHP-Ⅱ. The results showed that the experimental dose of AHP-Ⅱ had no damage to cells by CCK-8 method， which indicates that the reduction of inflammatory factors secreted by cells treated by AHP-Ⅱ is not due to its cytotoxic effect. AHP-Ⅱ groups （25， 50， 100 μg·mL-1） decreased TNF-α content durig hepatocyte injury. At the same time， the high-dose AHP-Ⅱ group can reduce the secretion of ROS durig hepatocytes injury， and the high-dose AHP-Ⅱ group has the strongest effect in inhibiting ehe conrent of ROS. After the addition of AHP-Ⅱ， the phosphorylation level of JNK2 protein decreased in a dose-dependent manner， and the AHP-Ⅱ high-dose group had the strongest inhibitory effect. This indicate that the polysaccharide AHP-Ⅱ can play an immunoprotective role by reducing the protein content of P-JNK2 and inhibiting the levels of TNF-α and ROS. The results of this study provide a scientific reference for the hepatoprotective effect of A. giraldii， and promote the further development and utilization of the resources of A. giraldii.

Key words： Acanthopanax giraldii polysaccharide， lipopolysaccharide， liver injury， JNK

紅毛五加為五加科多年生灌木，它的藥用部位為密生刺毛的莖皮，稱為紅毛五加皮。五加科植物大多具有祛風(fēng)濕、通關(guān)節(jié)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效。有研究結(jié)果顯示，刺五加水提物能顯著增加小鼠單核一巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并能顯著提高小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的程度，此外，顯著增加了小鼠的脾臟和胸腺的臟器系數(shù)，提示刺五加能增強(qiáng)機(jī)體免疫防御能力，并且這種免疫增強(qiáng)作用與促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化有關(guān)（王瑞強(qiáng)等，2013）。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給小鼠腹腔注射刺五加水提物后，可檢測到刺五加水提物明顯抑制了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在LPS&IFN-γ誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生的NO、 ZYM誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生的 O2- · 和PMA誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生的H2O2的含量，結(jié)果提示刺五加水提物可能通過抑制活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)發(fā)揮其抗炎功效（林秋葉，2007）。這些結(jié)果表明大多數(shù)由五加科提取的有效成分都有抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)免疫細(xì)胞活性的雙重作用（Chien et al.， 2015;孫永杰，2012）。課題組前期從中藥紅毛五加中提取了一種單一組分紅毛五加多糖AHP-Ⅱ，前期研究發(fā)現(xiàn)它具有促進(jìn)免疫活性的作用，而現(xiàn)有的關(guān)于紅毛五加多糖抗炎的研究卻少有報(bào)道，為了進(jìn)一步探究AHP-Ⅱ?qū)Ω螕p傷的作用，我們用LPS誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞BRL損傷，模擬了人類免疫性肝損傷模型，用AHP-Ⅱ刺激，來探究單一組分是否具有“保肝”的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640（Gibco公司）;胎牛血清（Gibco公司）;青鏈霉素混合液（購自北京索萊寶科技有限公司）LPS（sigma）;TNF-α檢測盒（eBioscience）;活性氧檢測試劑盒（Beyotime）;磷酸化兔抗鼠JNK2和P-JNK2抗體（ Cell Signal Technoloy）;辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔的二抗（Cell Signal Technoloy）;化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo）;紅毛五加多糖AHP-Ⅱ由課題組前期制得;BRL大鼠肝細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肝細(xì)胞BRL，用含有10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，隔天傳代。隨著實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌臃N于培養(yǎng)板上。

1.2.2 AHP-Ⅱ細(xì)胞毒性檢測 將大鼠肝細(xì)胞BRL，以每孔103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分為（1）空白組、（2）AHP-Ⅱ低劑量組（25 μg·mL-1）、（3）AHP-Ⅱ中劑量組（50 μg·mL-1）、（4）AHP-Ⅱ高劑量組（100 μg·mL-1）?？瞻捉M添加等量的無血清1640培養(yǎng)基，各組分別按分組加好藥物，放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用CCK-8檢測AHP-Ⅱ?qū)?xì)胞的增殖毒性。

1.2.3 ELISA檢測TNF-α的含量 將大鼠肝細(xì)胞BRL，以每孔106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板內(nèi)。按照1.2.2的方法培養(yǎng)細(xì)胞，另增設(shè)LPS模型對照組（40 μg·mL-1），各組分別按分組加好藥物，放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集上清，按照ELISA說明書檢測上清中的TNF-α細(xì)胞因子的含量。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS的表達(dá) 將大鼠肝細(xì)胞BRL，以每孔106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板內(nèi)。按照1.2.3的方法培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測ROS的含量。

1.2.5 用western blot檢測JNK磷酸化情況 按1.2.3方法處理細(xì)胞后，加藥刺激1 h后提取總蛋白，檢測JNK2蛋白及其磷酸化蛋白的水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，多組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的AHP-Ⅱ?qū)Ω渭?xì)胞毒性的影響

為排除細(xì)胞數(shù)目對炎癥因子的影響，用CCK-8檢測了AHP-Ⅱ不同工作濃度下對肝細(xì)胞的毒性作用，由表1結(jié)果可知，在低、中、高三個(gè)不同濃度下，AHP-Ⅱ?qū)?xì)胞增殖沒有毒性作用。

2.2 不同濃度的AHP-Ⅱ?qū)Ω螕p傷后分泌細(xì)胞因子的影響

TNF-α是引起急慢性肝損傷的重要因素之一，其具有細(xì)胞毒性作用，能夠通過激活T， B淋巴細(xì)胞、增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，來間接或直接引起肝細(xì)胞的免疫損傷，還可誘導(dǎo)TNF-α本身、IL-8、IL-6等細(xì)胞因子的大量分泌， 介導(dǎo)肝細(xì)胞的功能受損，加重肝功能損傷。為了構(gòu)建免疫性肝損傷模型，我們用LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞，通過檢測LPS刺激后肝細(xì)胞分泌TNF-α的含量，來驗(yàn)證肝損傷模型是否建立。由表2結(jié)果可知，與空白組相比較，LPS刺激后TNF-α的含量顯著上升（P<005）。不同劑量組的AHP-Ⅱ均可使肝細(xì)胞損傷后的TNF-α含量下降（表2）。

2.3 不同濃度的AHP-Ⅱ?qū)Ω螕p傷后分泌ROS的影響

肝細(xì)胞增殖、靜息的相互轉(zhuǎn)變一旦失控，會對肝臟正常發(fā)育、肝再生甚至肝癌發(fā)生等造成重大影響。目前的研究表明活性氧（ROS）可在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，高水平ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死，低水平ROS誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS模型組與空白組相比，ROS的含量顯著升高。

2.4 AHP-Ⅱ?qū)NK信號通路的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路與肝臟疾病關(guān)系密切，多種肝臟應(yīng)激與損傷均存在JNK信號通路的激活。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS組與空白組相比，有顯著性差異。

3 討論

爆發(fā)性肝衰竭是急性肝損傷的致命并發(fā)癥，具有預(yù)后差死亡率高的特點(diǎn)。在發(fā)展中國家，病毒感染是導(dǎo)致爆發(fā)性肝衰竭最常見的原因，然而在西方國家，藥物誘發(fā)的急性肝損傷已成為FHF的主要病因。涉及病原體誘導(dǎo)FHF的機(jī)制有兩方面，一方面，病原體直接破壞肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，觸發(fā)細(xì)胞信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，然后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。另一方面，受損的肝細(xì)胞釋放內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMPS），激活了自身免疫系統(tǒng)，刺激免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，這又加重了肝細(xì)胞的損傷最終導(dǎo)致爆發(fā)性肝衰竭。盡管在FHF的發(fā)病機(jī)制和診斷上已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，目前卻尚無有效的治療方法。目前FHF可用的治療方法是肝移植，但由于缺乏捐獻(xiàn)者的肝臟而受到限制。因此越來越多的研究人員專注于尋找更有效的治療FHF的藥物（Sultan et al.， 2017）。

目前已知的黃酮類（水飛薊素，黃芩苷，槲皮素）（張強(qiáng)等，2014 ;張立海和慈慧，2012;翁書強(qiáng)等，2015）、萜類化合物（穿心蓮內(nèi)酯，白樺脂酸）（王雷，2016;徐立新和嚴(yán)麗軍，2017）、生物堿（苦參堿）（高艷等，2013）、多酚類（苦丁茶多酚）（趙欣等，2017）、多糖類（當(dāng)歸多糖，枸杞多糖）（宋之臻，2016;章培軍等，2011），都具有保肝降酶的功效。為了開發(fā)現(xiàn)有中藥的更大價(jià)值，我們提取了紅毛五加多糖AHP-Ⅱ，同時(shí)結(jié)合大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，用脂多糖（LPS）離體攻擊的免疫手段，構(gòu)建了在病理生理機(jī)制上和人類肝損傷接近的免疫性肝損傷體外模型，來探究紅毛五加多糖對免疫性肝損傷的保護(hù)作用。

現(xiàn)有的關(guān)于五加科多糖的護(hù)肝作用大多集中在酒精性肝損傷和化學(xué)性肝損傷上，關(guān)于免疫性肝損傷的研究少有報(bào)道。盧芳等（2016）發(fā)現(xiàn)刺五加多糖通過半胱氨酸和蛋氨酸代謝、膽汁的分泌、檸檬酸循環(huán)等代謝通路發(fā)揮肝損傷的保護(hù)作用;張正光等（2011）發(fā)現(xiàn)細(xì)柱五加果實(shí)乙醇提取物通過降低血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶CAST）的活性及肝組織中丙二醛（MDA）的含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性來發(fā)揮對化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用;郝乘儀等（2012）發(fā)現(xiàn)刺五加酸（AA） 通過升高丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ AST）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的活力、抑制小鼠肝細(xì)胞DNA的損傷來發(fā)揮對酒精性肝損傷的保護(hù)作用;鞠洋等（2005）發(fā)現(xiàn)紅毛五加多糖通過降低過高的NO含量來發(fā)揮肝保護(hù)作用。

LPS能夠觸發(fā)許多的病理學(xué)事件，包括炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如TNF-α。TNF-α能夠介導(dǎo)肝細(xì)胞的壞死，產(chǎn)生其他細(xì)胞因子，例如IL-1B、IL-6，在肝損傷的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，而抑制TNF-α的表達(dá)能夠減輕肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，在用LPS處理后，肝細(xì)胞內(nèi)TNF-α水平顯著上升，這表明LPS可以誘導(dǎo)肝損傷模型。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)，AHP-Ⅱ可以顯著降低炎癥細(xì)胞因子的水平，使其恢復(fù)到正常水平，這一結(jié)果表明，AHP-Ⅱ可能通過其抗炎作用發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。ROS參與肝硬化的發(fā)病機(jī)制，也是肝癌的危險(xiǎn)因素，中、高濃度的ROS通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。 本研究從肝損傷后ROS水平的變化關(guān)系入手，來探討AHP-Ⅱ?qū)τ诟螕p傷過程中的關(guān)鍵作用。本研究表明，LPS刺激肝細(xì)胞后，細(xì)胞中ROS的水平顯著上升，而用AHP-Ⅱ處理后，ROS的水平顯著降低，這說明AHP-Ⅱ可能通過其抗氧化作用發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。

MAPK信號通路參與免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡等多種病理、生理過程。然而關(guān)于LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷中MAPK信號通路的研究還少有報(bào)道（王鳳華等，2017;田靜等，2016;朱瑞芳等，2006）。JNK的活化具有雙向調(diào)節(jié)的作用，JNK過度激活會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路，低表達(dá)則會滿足細(xì)胞的正常分化增殖等生長活動。因此無論是肝細(xì)胞炎癥還是死亡，JNK在多種肝臟應(yīng)激與損傷中起著重要的調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步探究AHP-Ⅱ?qū)τ贚PS誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用的機(jī)制，我們檢測了JNK2磷酸化的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS可通過促進(jìn)JNK2蛋白磷酸化來誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，而中高濃度的AHP-Ⅱ可通過抑制JNK2蛋白磷酸化來抑制炎癥反應(yīng)。綜上所述，紅毛五加多糖AHP-Ⅱ可以通過降低JNK的磷酸化蛋白含量來抑制炎癥因子TNF-α及ROS的水平進(jìn)而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。

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