林鋒強(qiáng) 程曉霞 朱小麗 陳少鶯 江丹丹

摘?要：【目的】旨在研究福建省番鴨小鵝瘟病流行毒株及病毒遺傳變異狀況?！痉椒ā繌母＝ㄊ》喼饕曫B(yǎng)區(qū)收集臨床疑似番鴨小鵝瘟病例30份，進(jìn)行病原學(xué)檢測、病原分離、病毒感染試驗(yàn)、基因片段序列分析?！窘Y(jié)果】顯示30份疑似病例中有15份為番鴨源鵝細(xì)小病毒（Muscovy duck-origin goose parvovirus，MDGPV）感染，占比50%。分離到的15株MDGPV均能致死番鴨胚，番鴨感染后發(fā)病率為60%～100%，死亡率為40%～60%。15株MDGPV分離毒VP1基因核苷酸同源性在99.5%以上，與MDGPV-PT株同源性在96%以上，未發(fā)生堿基缺失、插入或基因重組，較為穩(wěn)定;而與番鴨細(xì)小病毒MDPV-P株同源性小于90%。進(jìn)化樹分析顯示15株分離毒與MDGPV-PT株屬于同一分支，而與MDPV-P株屬于不同分支?！窘Y(jié)論】福建省2018年流行的MDGPV毒株與1997年分離的MDGPV-PT株致病性和基因序列特性相似，無明顯變化，生物學(xué)特性和基因組特性比較穩(wěn)定，遺傳變異程度小。

關(guān)鍵詞：番鴨小鵝瘟;番鴨源GPV;流行毒株;病原

中圖分類號：S 855文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）07-796-06

Abstract：【Objective】Etiology of the epidemic Muscovy duck-origin goose plague （MDGP） and genetic variation of the pathogenic parvovirus （MDGPV） in Fujian were studied. 【Method】 Clinic specimens from 30 suspected MDGP cases at the major duck breeding areas in Fujian were collected for the etiological detection， pathogen isolation， virus infection test， and gene fragment sequence analysis.【Result】On the 30 cases， 15 were confirmed to be MDGPV-positive. All isolated 15 MDGPV could cause death to the Muscovy duck embryos. The morbidity and mortality on the ducks from the viral infection were 60%-100% and 40%-60%， respectively. The nucleotide homology of VP1 gene of the MDGPV isolates was greater than 99.5%. The homology of the isolates with MDGPV-PT was higher than 96% with no deletion and insertion on the nucleobases or gene recombination. On the other hand， its homology with MDPV-P was less than 90%. The phylogenetic tree analysis showed that the 15 isolates belonged to the same branch as MDGPV-PT but differed from MDPV-P. 【Conclusion】The pathogenicity and gene sequence of the MDGPV strain prevalent in 2018 and those of the MDGPV-PT isolated in 1998 were similar with no apparent mutations. The biological and genomic characteristics of the MDGPV isolates seemed stable with little genetic variation throughout the years.

Key words：muscovy duck-origin goose plague; muscovy duck derived goose parvovirus; prevalent strain; pathogen

0?引言

【研究意義】番鴨小鵝瘟病是主要侵染20日齡以內(nèi)番鴨，臨床主要表現(xiàn)為不同程度腹瀉、部分病番鴨腸黏膜脫落形成栓塞的番鴨常見病害[1-2]。發(fā)病日齡越小，死亡率越高，發(fā)病率50%～70%，病死率40%～65%。其病原為番鴨源鵝細(xì)小病毒（Muscovy Duck-origin Goose parvovirus， MDGPV）[3]。臨床上使用抗菌素和番鴨細(xì)小病毒病疫苗、鵝細(xì)小病毒病疫苗均不能控制病情，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。通過對臨床疑似番鴨小鵝瘟樣品檢測、病原分離和鑒定，分析番鴨小鵝瘟病流行毒株的生物學(xué)特性及病毒遺傳變異狀況，對臨床番鴨小鵝瘟病的防控具有指導(dǎo)意義。

【前人研究進(jìn)展】目前對MDGPV的研究主要集中在病毒檢測方法的建立、應(yīng)用以及病毒的分離，如2007年在四川德陽某番鴨場分離得到的MDGPV-DY 株[5-7]。而基因研究方面，在Genbank登錄的番鴨源鵝細(xì)小病毒全基因序列只有MDGPV-PT 株（登錄號JF926695）和DY株（登錄號EF515837）[8]。1997年，番鴨小鵝瘟病在福建省莆田、福清等番鴨飼養(yǎng)區(qū)出現(xiàn)，隨后在我國廣東、浙江、江西、江蘇、四川等省份相繼發(fā)生，荷蘭、德國、俄羅斯、匈牙利、法國等國家也有該病的報(bào)道，分布極其廣泛，使其成為嚴(yán)重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病[3-4，9-13]。發(fā)病日齡5～25日齡，日齡越大，易感性越低。本病無明顯季節(jié)性，但以冬季和早春多發(fā)。對其流行病學(xué)研究，僅見在鵝以及櫻桃谷鴨中有對某個(gè)地區(qū)GPV流行的報(bào)道[14]，對番鴨小鵝瘟的流行情況調(diào)查未見報(bào)道。

【本研究切入點(diǎn)】福建省作為主要番鴨飼養(yǎng)區(qū)，番鴨小鵝瘟病的危害尤其嚴(yán)重[4]。自1997年發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過多年的傳播與發(fā)展，福建省區(qū)域內(nèi)番鴨小鵝瘟病毒株是否發(fā)生了變異目前未有報(bào)道。

【擬解決的關(guān)鍵問題】為了對番鴨小鵝瘟的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，于2018年在福建省莆田、漳州、三明將樂、南平建甌等地的番鴨飼養(yǎng)場收集臨床疑似樣品進(jìn)行病毒檢測，對流行毒株進(jìn)行分離鑒定，分析評價(jià)流行病株的生物學(xué)和分子生物學(xué)特性，并與2007年分離的MDGPV-PT株進(jìn)行致病性和基因片段序列分析比較，評價(jià)2018年番鴨小鵝瘟病毒流行毒株與1997年分離毒株的差異，為其防治措施的提升和相應(yīng)疫苗的更新提供參考。

1?材料和方法

1.1?試驗(yàn)動物及試劑

85羽1日齡雛番鴨購自莆田廣東溫氏家禽有限公司;抗MDGPV單克隆抗體致敏乳膠、抗番鴨細(xì)小病毒（muscovy duck parvovirus， MDPV）、MDGPV單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)研制;反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA RevertAid First Strand cDNA Systhesis Kit（Thermo Scientific公司）、樣品基因組提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、PCR試劑Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）購自Thermo Scientific公司。MDGPV-PT由本實(shí)驗(yàn)室保存[4]。

1.2?樣品來源 2018年1～12月從福建省主要番鴨飼養(yǎng)區(qū)收集臨床疑似番鴨小鵝瘟病例，其中莆田6份、漳州8份、三明將樂12份、南平建甌4份，共計(jì)30份。臨床病料取肝臟、脾臟、胰腺組織，4℃保存，利用免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)行檢測MDPV和MDGPV。

1.3?免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢測取收集的胰腺組織制作冰凍切片，丙酮固定后，分別加適當(dāng)稀釋的抗MDGPV或MDPV單抗，37℃濕盒30 min，生理鹽水洗滌3次，加工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC，37℃濕盒30 min，生理鹽水洗滌3次后以50%PBS-甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)亮綠色熒光判定為陽性。

1.4?MDRV、NDRV、DHV病原檢測引物

按照番鴨呼腸孤病毒（muscovy duck reovirus， MDRV） MW9710株S4基因（KY580159）設(shè)計(jì)引物，上游引物MDRV P1：CTA CCT CAA ATG GTC GCA ATG GAG;下游引物MDRV P2：GAT CGT GTT GCC AAG TTA GAA CGA G（擴(kuò)增長度500 bp，退火溫度56℃）。按照鴨病毒性肝炎（duck hepatitis virus， DHV）GD株（KM017068）基因設(shè)計(jì)引物，上游引物DHV P1：CCC TTC ATT AGC AAG TGC TGT ACT;下游引物DHV P2：ACG CTG GTT AGC AAC ACC（擴(kuò)增長度700 bp，退火溫度52.5℃）。按照新型鴨呼腸孤病毒（New-type duck reovirus， NDRV）NP03株S3基因（GQ888710）設(shè)計(jì)引物，上游引物NDRV P1：ACC TCA GGA TAT CGC TGA AAC T;下游引物NDRV P2：CTC CAT CCC TGC AGC ACA TGT AAA G（擴(kuò)增長度586 bp，退火溫度55℃）。

1.5?MDRV、NDRV、DHV病原RT-PCR檢測將臨床樣品按照1∶5比例磨成勻漿，取200 μL按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒RNA。將所得的RNA按照RevertAid First Strand cDNA Systhesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后利用Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）試劑進(jìn)行PCR。將所得到的產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠，120 V電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.6?病原分離和毒價(jià)測定取15份MDGPV陽性病料接種12日齡番鴨胚，每份接3枚，0.2 mL·枚-1，每天觀察胚死亡情況，將48～96 h死亡胚收集尿囊液;未死亡胚的繼續(xù)傳2代，收集尿囊液，-20℃保存。死亡胚心制作冷凍切片，用免疫熒光檢測MDGPV和MDPV;尿囊液提取RNA進(jìn)行MDRV、NDRV、DHV病原RT-PCR檢測。將15份均能致死番鴨胚的尿囊液用LPA方法進(jìn)行毒價(jià)測定。方法如下：生理鹽水將待檢樣品作連續(xù)2倍倍比稀釋后，各取10 μL不同稀釋度的待檢樣品與等量致敏乳膠在潔凈的玻片或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板板蓋上混勻，37℃水浴溫箱中靜置5～15 min，觀察凝集反應(yīng)。試驗(yàn)設(shè)致敏乳膠對照、抗原對照和抗原加稀釋液對照。以能出現(xiàn)“+”凝集的抗原最高稀釋度的倒數(shù)為該抗原的凝集價(jià)。

1.7?攻毒試驗(yàn) 85羽7日齡雛番鴨隨機(jī)分成17組，每組5羽。分成15株MDGPV分離株組、MDGPV-PT株組和空白對照組。MDGPV攻毒劑量為LPA效價(jià)24，0.3 mL·羽-1，空白對照組注射Hanks液0.3 mL。攻毒后每日觀察和記錄番鴨發(fā)病和死亡情況。

1.8?MDGPV分子流行病學(xué)分析

為了測定15株MDGPV分離毒3 321～4 195位核苷酸序列，按照MDGPV PT株（KY511293）設(shè)計(jì)引物，上游引物MDGPV P1：GAA TCA GAC CCA AGT CTC TT;下游引物MDGPV P2：CAA GAT CTG AAC TCG TAG GAG（擴(kuò)增長度875 bp，退火溫度55.9℃）。將15株MDGPV分離毒200 μL按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒DNA。將所得的DNA利用Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）試劑進(jìn)行PCR。將所得到的產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠，120 V電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定及進(jìn)化樹分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?番鴨小鵝瘟病臨床檢測情況

番鴨小鵝瘟病一年四季均可發(fā)生，臨床共計(jì)收集疑似番鴨小鵝瘟病病料30份，經(jīng)過熒光和PCR檢測，其中15份為MDGPV感染，占比為50%;3份為MDPV感染，占比為10%，其余12份均為多種病原混合感染，占比40%，其中主要為番鴨細(xì)小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病，MDGPV和MDPV混合感染病例7例，MDGPV和MDRV混合感染病例5例。臨床病料胰腺熒光檢測結(jié)果圖1。

2.2?番鴨MDGPV病毒分離及檢測

15份MDGPV病料在番鴨胚上盲傳3代，結(jié)果顯示15份病料接種番鴨胚后均100%死亡。對所收集胚體進(jìn)行熒光檢測，尿囊液進(jìn)行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)僅能檢測到MDGPV，其他病毒如MDPV、DHV、MDRV、NDRV均未檢測到（表1）。

2.3?番鴨MDGPV LPA效價(jià)測定

利用MDGPV-LPA方法檢測15份尿囊液毒價(jià)，LPA效價(jià)范圍在24～26（表2）。

2.4?番鴨MDGPV攻毒試驗(yàn)15株MDGPV感染番鴨后，發(fā)病日齡在4～5 d，其中7～14日齡為多發(fā)日齡。主要表現(xiàn)為拉稀、不愛站立、少食。發(fā)病率為60%～100%;番鴨死亡日齡為感染7～14 d，死亡率為40%～66.7%（表4）。死亡番鴨解剖胰腺有灰白色壞死點(diǎn)，個(gè)別腸道出現(xiàn)栓塞，其余器官無明顯變化。20日齡后番鴨逐漸恢復(fù)，但生長緩慢，變成僵鴨。MDGPV-PT株感染番鴨后發(fā)病率80%，死亡率40%，臨床癥狀和剖檢病變與流行毒株感染后情況一致。結(jié)果顯示15株分離毒的與MDGPV-PT株發(fā)病率、死亡率和臨床癥狀相似。

2.5?番鴨MDGPV分子流行病學(xué)分析

15株MDGPV分離毒堿基序列特征與MDGPV-PT株保持一致，同源性在96%以上，未發(fā)生堿基缺失、插入或基因重組，較為穩(wěn)定。其中MDGPV-TH、XY、QS、07株同源性在99.8%以上，與PT株同源性在96.8%-97.2%;其余11株同源性在99.5%以上，與PT株同源性在96.2%～96.5%。所有分離株與番鴨細(xì)小病毒MDPV-P株同源性小于90%。進(jìn)化樹分析顯示15株分離毒與MDGPV-PT株屬于同一分支，而與番鴨細(xì)小病毒MDPV-P株屬于不同分支（圖2）。

3?討?論

目前福建省番鴨飼養(yǎng)地區(qū)主要集中在莆田、漳州、建甌、將樂，飼養(yǎng)量占到全省的80%左右。對4個(gè)地區(qū)2018年收集的30份病料分析來看，MDGPV發(fā)生率為50%。從發(fā)生季節(jié)來看，冬季（12月至翌年2月）收集7份，占比46.7%;春季（3～5月）收集5份，占比33.3%;夏秋兩季僅收集到3份，表明番鴨細(xì)小病毒病一年四季均能發(fā)生，但主要以冬春季節(jié)多發(fā)。

番鴨小鵝瘟1997年最早在福建莆田、福清等番鴨飼養(yǎng)區(qū)出現(xiàn)，1998年在莆田發(fā)病鴨群中分離鑒定了MDGPV-PT株，是由GPV和MDPV流行株之間發(fā)生基因重組后形成的新基因型強(qiáng)毒株?；蚪M由兩個(gè)開放閱讀框組成，其中右側(cè)閱讀框相互重疊，編碼衣殼蛋白VP。其中VP1基因編碼的VP1蛋白，位于病毒粒子外殼，可能與病毒的毒力及致病性有關(guān)[15]。同源性分析顯示：（1）MDGPV和MDPV同源性為79.7%～89.4%。季芳等研究認(rèn)為MDGPV和MDPV的VP1基因同源性為87.2%[16]。張?jiān)频萚17]研究認(rèn)為MDGPV和MDPV的VP1基因同源性79.7%～88.7%。Poonia等[18]研究認(rèn)為美國新型MDPV與MDGPV-PT株同源性83.5%。本研究分離到15株MDGPV分離毒與MDPV同源性均也小于90%。（2）MDGPV和GPV同源性為88.1%～91.2%。其中GPV-B株、YG株、VG32/1株與MDGPV-PT株同源性為分別為89.0%、88.2%和88.8%[4，13]。（3）不同MDGPV分離毒之間同源性在95.2%～99.6%[16]。MDGPV-PT株與DY株同源性為98.8%[4，13]，與本研究分離到的15株MDGPV VP1基因同源性大于96%相一致。進(jìn)化樹分析顯示15株分離毒與MDGPV-PT株屬于同一分支，而與番鴨細(xì)小病毒MDPV-P株和鵝源GPV屬于不同分支。因此番鴨源GPV具有不同于鵝源GPV與MDPV的遺傳進(jìn)化方向。

從分離的流行毒株特性來看，與1997年分離的PT株特性相似，基因進(jìn)化樹顯示15株分離毒與PT株屬于同一分支。綜上所述，雖然MDGPV在我國流行了20多年，但是病毒生物學(xué)特性和基因組特性比較穩(wěn)定，變異程度小。

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（責(zé)任編輯：張?梅）