林勝 李強 夏曉峰 尤民生

摘?要：【目的】探究Bt水稻對褐飛虱若蟲腸道可培養(yǎng)細菌組成結構的影響，為轉基因水稻的安全性評價提供科學依據?！痉椒ā坷脗鹘y(tǒng)微生物純培養(yǎng)法分別從取食非轉基因（CK）水稻和轉crylAb抗蟲（Bt）水稻的褐飛虱腸道內分離細菌，利用16s rDNA對分離菌株進行鑒定，比較分析轉基因水稻對褐飛虱若蟲腸道微生物群落結構的影響。【結果】研究結果顯示在取食CK水稻和Bt水稻的褐飛虱腸道內各分離獲得7株細菌。取食CK水稻的褐飛虱腸道細菌分別屬于3個門5個屬;而取食Bt水稻的褐飛虱腸道細菌分別屬于2個門4個屬;分離獲得頻率最高的是變形菌門細菌Proteobateria，其中取食兩種水稻均能分離獲得變形菌門的泛菌屬Pantoea，以及厚壁菌門Firmicutes的葡萄球菌屬Staphylococcus等2個屬的細菌。取食CK水稻的褐飛虱腸道內分離獲得變形菌門的草螺菌屬Herbaspirillum和不動桿菌屬Acinetobacter，以及放線菌門的微桿菌屬Microbacterium等3個特異性細菌屬;取食Bt水稻的褐飛虱腸道內分離得到變形菌門的腸桿菌屬Enterobacter和伯克氏菌屬Burkholderia等2個特異性細菌屬。【結論】取食非轉基因水稻和轉基因水稻的褐飛虱腸道可培養(yǎng)細菌組成存在一定的差異。本研究為后續(xù)深入研究褐飛虱腸道共生細菌的功能，以及轉基因水稻對非靶標生物腸道細菌的影響提供了材料和基礎。

關鍵詞： 褐飛虱;轉基因水稻;腸道細菌;非靶標效應;生物安全

中圖分類號：S 663.4文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）07-802-08

Abstract：【Objective】 The present study aims to explore the effects of Bt rice on gut bacterial structure of the Nilaparvata lugens nymphae and to provide evidence for rational safety assessment of Bt rice. 【Method】 Gut bacteria from BPH feeding on non-transgenic rice （CK） and transgenic rice （Bt） were isolated using traditional culture methods， and were identified using 16s rDNA. The composition of isolates was compared between these two treatments. 【Results】 The results showed that seven bacterial strains were isolated from the gut of N. lugens feeding on either CK or Bt rice. Three phyla and five genera of the gut bacteria were identified from N. lugens feeding on CK rice， while two phyla and four genera of the gut bacteria from N. lugens feeding on Bt rice. The taxa of bacteria identified from the guts of N. lugens either feeding on CK rice or Bt rice were Proteobateria （including the genus of Pantoea） and Firmicutes （including the genus of Staphylococcus）. Herbaspirillum Acinetobacter and Microbacterium were specific genera from the CK treatment， while Enterobacter， and Burkholderia from the Bt treatment. 【Conclusion】 The composition of culturable bacteria in the N. lugens gut was different beween the CK treatment and the Bt treatment. The findings provide an important foundation for further studies on the function of symbiotic bacteria in N. lugens， and the effects of transgenic rice on the gut bacteria of non-target species.

Key words：Nilaparvata lugens; genetically modified rice; gut bacteria; non-target effect; biosafety

0?引言

【研究意義】自1989年抗蟲Bt水稻首次研制成功，近年來，我國Bt水稻的研發(fā)得到了迅速的發(fā)展[1]。目前，我國正式獲得國家安全證書的抗蟲轉基因水稻品種僅有兩種，分別為華恢1號和Bt 汕優(yōu)63，于2009年首次獲得，到期后于2014年重新獲得安全證書，但仍未批準可以進行商業(yè)化種植[2]，這其中很大一部分原因是這些轉基因抗蟲水稻的環(huán)境安全問題還未明確。褐飛虱Nilaparvata lugens（Brown planthopper， BPH）是稻田常見的一種害蟲，其蟲體小、繁殖快、易于遷飛，極易爆發(fā)成災。自1980年以來，我國每年受褐飛虱危害的水稻面積約占水稻種植總面積的一半，約1 330萬～2 000萬hm2，由此造成稻谷產量直接損失達到10億～15億kg [3-4]。研究轉Bt水稻對褐飛虱腸道細菌結構的影響，可為全面評價轉基因水稻的安全性提供參考?！厩叭搜芯窟M展】關于轉基因抗蟲水稻的環(huán)境安全問題，已有的研究主要包括轉基因抗蟲水稻對生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的影響（包括節(jié)肢動物和土壤微生物）、對靶標害蟲的抗性影響、對非靶標生物（包括非靶標害蟲、天敵、傳粉昆蟲、中性昆蟲等）的安全性等[5-9]。【本研究切入點】迄今的研究很少關注轉基因抗蟲水稻對非靶標生物腸道共生微生物的影響，目前僅發(fā)現(xiàn)一篇文獻報道利用Biolog-Eco方法檢測轉cry1Ab粳稻對褐飛虱腸道微生物多樣性的影響[10]。腸道共生微生物在昆蟲的食物消化、營養(yǎng)利用、生長發(fā)育和生殖調控及抵御病原物和有害物質的過程中發(fā)揮著重要的作用 [11-12]，同時在昆蟲免疫、影響殺蟲劑抗性 [13-15]以及信息素的合成 [14，6]等方面也起到重要的作用。【擬解決的關鍵問題】利用傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法結合分子鑒定技術，分析取食轉基因Bt水稻對非靶標害蟲褐飛虱腸道細菌結構的影響，研究結果將有助于進一步明確Bt水稻的環(huán)境安全性。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試水稻?轉crylAb抗蟲水稻（株系mf-MH3301）（簡稱Bt水稻）及其親本對照非轉基因水稻閩恢3301（簡稱CK水稻）由福建省農業(yè)科學院農業(yè)遺傳工程重點實驗室提供。轉cry1Ab抗蟲水稻品種通過農桿菌介導將雙T-DNA載體pCDMARUBb-Hyg轉化優(yōu)良水稻恢復系閩恢3301，并通過多代自交、檢測與選擇，獲得無選擇標記轉cry1Ab抗蟲基因水稻純合株系，cry1Ab基因已整合到受體植物的染色體上，并且可穩(wěn)定地遺傳和表達。

1.1.2?供試昆蟲?供試褐飛虱系2011年由福建農林大學病毒研究所提供蟲源，飼養(yǎng)于福建農林大學應用生態(tài)研究所人工氣候室中，褐飛虱分別飼養(yǎng)在Bt水稻和CK水稻上，至今已在實驗室中連續(xù)飼養(yǎng)5年，飼養(yǎng)條件：溫度（27±2）℃，光照L∶D=14∶10，光強度3 500～4 000 lx，相對濕度60%～70%。

1.1.3?供試培養(yǎng)基?每升培養(yǎng)基中的有效成分及其含量如下，所有培養(yǎng)基均調節(jié)pH至7.0，于121℃高壓滅菌20 min，備用。

LB培養(yǎng)基：5 g酵母抽提物，10 g NaCl，10 g蛋白胨，15 g瓊脂;高氏一號培養(yǎng)基（G）：20 g可溶性淀粉，15 g瓊脂，1 g KNO3，0.5 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g NaCl，0.01 g FeSO4·7H2O;營養(yǎng)瓊脂平板（NA）：3 g牛肉膏，5 g NaCl，10 g蛋白胨，15 g瓊脂;沙門菌培養(yǎng)基（SS）：5 g牛肉膏粉，5 g蛋白陳，15 g瓊脂，3.5 g三號膽鹽，10 g乳糖，8.5 g檸檬酸鈉，8.5 g硫代硫酸鈉，1 g檸檬酸鐵，0.025 g中性紅，0.000 33 g煌綠。

1.2?試驗方法

1.2.1?褐飛虱腸道解剖?分別取飼養(yǎng)在Bt水稻和CK水稻上的褐飛虱4～5齡若蟲100頭，用冰使其昏迷，用75%乙醇對蟲體進行表面消毒處理，再用無菌雙蒸水清洗數次。在解剖鏡下用解剖鑷子去除頭部，然后夾住褐飛虱頭胸部和腹部末位置，輕輕將腸道以及內臟器官拉出，用無菌雙蒸水漂洗，去除其他內臟器官，取出腸道放置于裝有200 μL PBS緩沖液（pH 7.0）的1.5 mL離心管中，將滅過菌的鋼珠置于離心管中于組織破碎儀上進行破碎勻漿。

1.2.2?褐飛虱腸道細菌的分離培養(yǎng)?將上述提取的腸道勻漿按照10-1、10-2、10-3進行稀釋，分別涂布于LB、NA、G和SS平板上，每種培養(yǎng)基平板3次重復。隨后，將平板置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～30 h，分別挑選大小、顏色、形態(tài)不一的單菌落于LB培養(yǎng)基中純化5代。

1.2.3?16S rDNA基因的擴增?單克隆菌株基因組DNA提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進行。以提取的總DNA為模板，細菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）進行腸道細菌16S rDNA的擴增 [17-18]。PCR反應體系為25 μL，包括50 ng DNA模板，1×EasyTaqSuperMix，5 pmol 引物PCR反應條件為：94℃預變性 5 min;30次循環(huán)，每次循環(huán)包括94℃變性30 s，62℃退火30 s和72℃延伸1 min;最后72℃再延伸10 min。擴增產物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測陽性的產物送至上海鉑尚生物技術有限公司進行測序。

1.2.4?褐飛虱腸道細菌系統(tǒng)發(fā)育分析?運用NCBI提供的Blast工具，將測序得到的16S rDNA序列與NCBI GenBank數據庫進行Blast比對，對所得菌種的DNA序列進行同源性搜索，獲得相似序列，利用MEGA6.0軟件進行序列比對以及進化樹的構建[19]，進化樹的構建方法采用鄰位相連（Neighbor-Joining）算法[20]，利用Bootstrap來檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

2?結果與分析

2.1?褐飛虱腸道細菌的分離鑒定

取食CK水稻的褐飛虱腸道共分離得到7株單一菌落，其中CK1的菌落顏色為橘黃色，較黏稠，不易挑取;CK2、CK5和CK6的菌落形態(tài)顏色較為相近，顏色為淺黃色;CK3在LB與SS培養(yǎng)基上均有生長，顏色淺黃白色;CK4生長在LB培養(yǎng)基上，生長較為緩慢，數量少;CK7菌落淺黃白色（圖1）。取食Bt水稻的褐飛虱腸道也分離得到7株單一的細菌菌落，其中Bt5菌落呈現(xiàn)橘黃色顏色較深，Bt3、Bt6、Bt7均為淺黃色比較相近，Bt2、Bt4為白色菌落（圖2）。

2.2?分離菌株的16S rDNA鑒定

以上述14株菌株的基因組DNA為模板擴增16S rDNA（圖3、4）。將回收的PCR產物進行測序，測序結果提交至GenBank。取食CK水稻的褐飛虱腸道細菌CK1-CK7的序列號為KU863620-KU863626;取食Bt水稻褐飛虱的腸道細菌Bt1-Bt7的序列號為KU863627-KU863630及KU867651-KU867653。Blast比對結果表明，CK1和CK5屬于泛菌屬Pantoea，CK3屬于不動桿菌屬Acinetobacter，CK7屬于草螺菌屬Herbaspirillum，它們均屬于變形菌門Proteobacteria;CK2和CK6屬于厚壁菌門Firmicutes葡萄球菌屬Staphylococcus;CK4屬于放線菌門Actinobacteria微桿菌屬Microbacterium（表1）。Bt1屬于腸桿菌屬Enterobacter，Bt3和Bt6屬于伯克氏菌屬Burkholderia，Bt7屬于泛菌屬Pantoea，它們均屬于變形菌門Proteobacteria;Bt2、Bt4和Bt5屬于葡萄球菌屬Staphylococcus，它們均屬于厚壁菌門Firmicutes（表1）。

2.3?系統(tǒng)發(fā)育分析

褐飛虱腸道細菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，取食CK水稻的褐飛虱腸道細菌形成3個家族的分支，其中CK1、CK3、CK5、CK7形成一個以變形菌門Proteobacteria為家族的大分支，CK2、CK6形成以厚壁菌門Firmicutes為家族的分支，CK4單獨形成分支歸屬于放線菌門Actinobacteria（圖5）。在取食Bt水稻的褐飛虱腸道細菌中，形成2個家族的分支，其中Bt1、Bt3、Bt6、Bt7形成一個以變形菌門Proteobacteria為家族的大分支，Bt2、Bt4、Bt5形成一個以厚壁菌門Firmicutes為家族的分支（圖6）。

3?討論與結論

昆蟲腸道中集聚著大量的微生物，在長期的進化過程中昆蟲腸道微生物與宿主發(fā)展出緊密的共生關系，對宿主的生長發(fā)育、抵御病原菌等起著重要的作用 [21-22]。腸道微生物群落的豐富度和群落結構功能的多樣性是衡量昆蟲腸道是否健康的一個重要指標 [23-24]。因此，評價Bt水稻對非靶標褐飛虱腸道微生物的影響，可以從另一個視角為探明Bt水稻的非靶標效應提供科學依據。

本研究借助傳統(tǒng)微生物分離純化技術分析了褐飛虱取食非轉基因和轉基因水稻后，其腸道內的細菌種類差異。盡管本研究獲得的菌株數量較少，但卻可以看到不同食物對腸道細菌的種類分布具有一定的影響，而高秀云等用Biolog-Eco方法分析認為，轉cry1Ab粳稻（KMD1/KMD2）對非靶標害蟲褐飛虱腸道微生物群落多樣性沒有明顯的負面影響[7]。本研究從取食CK水稻和Bt水稻的褐飛虱腸道內共分離獲得14株細菌，其中從取食兩種水稻的褐飛虱腸道內均能分離獲得2個屬的細菌，分別為變形菌門的泛菌屬Pantoea和厚壁菌門的葡萄球菌屬Staphylococcus。另外，取食CK水稻的褐飛虱腸道內分離得到3個特異性細菌屬，分別為變形菌門的草螺菌屬Herbaspirillum和不動桿菌屬Acinetobacter，以及放線菌門的微桿菌屬Microbacterium;取食Bt水稻的褐飛虱腸道內分離得到2個特異性細菌屬，分別為變形菌門的腸桿菌屬Enterobacter和伯克氏菌屬Burkholderia。當前結果提示取食Bt轉基因水稻有可能影響腸道可培養(yǎng)菌群的結構和多樣性，但其結果仍需要進一步通過更大規(guī)模的培養(yǎng)，同時結合高通量測序來驗證，該研究為未來進一步開展轉基因水稻對昆蟲腸道細菌的影響提供了依據。

在取食兩種水稻的褐飛虱腸道細菌中，分離頻率最高的菌均為變形菌門細菌，該結果與已有研究一致，例如學者對半翅目昆蟲點蜂緣椿象Riptortus clavatus腸道微生物的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門的Burkholderia屬在其中后腸腔中所占比例達95%以上[25]，同樣在鱗翅目棉鈴蟲[26]、家蠶[27]、小菜蛾[28]等腸道中均發(fā)現(xiàn)其腸道內的優(yōu)勢菌為變形菌門。本研究在對取食Bt水稻的褐飛虱腸道細菌的分析中，未發(fā)現(xiàn)放線菌門細菌，Bt蛋白是否會影響放線菌門的細菌有待進一步研究驗證。

本研究通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法分離鑒定褐飛虱若蟲腸道細菌，為后續(xù)的功能研究提供了菌體材料。已有研究表明，實驗室內可培養(yǎng)菌所占的比例不足自然界中微生物的1%[29]，所以腸道內低豐度以及不可培養(yǎng)菌很難通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法進行分離鑒定。利用分子生物學技術可以很好地解決上述問題，尤其近幾年高通量測序技術的飛速發(fā)展，能夠高靈敏度地定量昆蟲腸道內微生物，如王天召等利用高通量測序技術探明了褐飛虱成蟲腸道微生物群落結構和多樣性[30]。因此，下一步工作可以考慮利用高通量測序技術檢測轉基因水稻對褐飛虱腸道微生物多樣性和功能的影響。

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（責任編輯：林海清）