樊榮輝 羅遠(yuǎn)華 鐘淮欽 葉秀仙 黃敏玲

摘?要：【目的】齒蘭環(huán)斑病毒Odontoglossum ringspot virus（ORSV）是侵染蘭花的主要病毒，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值，建立快速、靈敏的檢測方法顯得尤為重要?！痉椒ā勘狙芯扛鶕?jù)ORSV的外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)了一組特異性引物，經(jīng)過一系列條件優(yōu)化，建立了該病毒的RT-LAMP（Reverse Transcription-Loop-mediated Iisothermal Amplification）檢測方法。【結(jié)果】結(jié)果顯示該方法能特異擴(kuò)增ORSV，與其他4種侵染蘭花的病毒（建蘭花葉病毒、菜豆黃花葉病毒、黃瓜花葉病毒和小蒼蘭花葉病毒）不發(fā)生反應(yīng);靈敏度為RT-PCR 的10倍。田間檢測20份樣品中，RT-LAMP和RT-PCR檢測結(jié)果一致。在產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼觀察即可判斷樣品是否感染ORSV，省去電泳分析的時(shí)間，并且增加了在田間的應(yīng)用價(jià)值?！窘Y(jié)論】該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、快速等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：齒蘭環(huán)斑病毒;RT-LAMP; 檢測

中圖分類號(hào)：S 436文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）07-824-05

Abstract：【Objective】To establish a rapid and reliable detection method on Odontoglossum ringspot virus （ORSV）， a major pathogen that seriously affects the ornamental value of orchids. 【Method】 Primers were designed for the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） assay from the conserved region in the coat protein （CP） gene of ORSV available in GenBank， and its reaction conditions optimized. 【Result】 Using the selected primer， RT-LAMP specifically identified ORSV but not Cymbidium mosaic virus （CyMV）， Bean yellow mosaic virus （BYMV）， Freesia mosaic virus （FreMV） or Cucumber mosaic virus （CMV）. The sensitivity of the assay was 10 times higher than that of RT-PCR， while identical in positive rate on test of 20 specimens. Furthermore， the amplification products of the newly developed method could be visually inspected using SYBR Green I without gel electrophoresis. 【Conclusion】The RT-LAMP assay was considered a specific， sensitive， and rapid method for ORSV detection.

Key words：Odontoglossum ringspot virus; RT-LAMP; detection

0?引言

【研究意義】 齒蘭環(huán)斑病毒Odontoglossum ringspot virus（ORSV）是蘭花中最嚴(yán)重的病毒之一， 建蘭、墨蘭等國蘭主要以單獨(dú)侵染ORSV為主。建蘭花葉病毒侵染蘭花，使植株出現(xiàn)花葉、畸形、壞死及花瓣變色等癥狀[1]，使品質(zhì)下降，影響觀賞價(jià)值，制約蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2-3]。目前尚缺乏有效防治建蘭花葉病毒的藥劑，最有效的方法是培育無毒種苗，而這就需要對(duì)種苗進(jìn)行病毒檢測及鑒定，因此，建立快速、靈敏的檢測技術(shù)尤為重要。【前人研究進(jìn)展】目前，病毒檢測主要有酶聯(lián)免疫法[1]和PCR檢測法[4-5]等方法。酶聯(lián)免疫法是目前較常用的一種方法[6]，但存在靈敏度不高和假陽性等缺點(diǎn)。近幾年，靈敏度更高的PCR技術(shù)已成為常規(guī)檢測手段[7]，但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求比較高，在基層的檢驗(yàn)檢疫部門推廣應(yīng)用難?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是應(yīng)用4條特異性引物，通過Bst DNA聚合酶，在水浴鍋中對(duì)靶基因進(jìn)行的一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[8]，該技術(shù)具有擴(kuò)增特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作快速簡便、檢測簡單等特點(diǎn)，擺脫了對(duì)PCR儀等昂貴儀器的依賴[9-11]，在基層單位的檢測更加方便?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于以上優(yōu)點(diǎn)，本研究針對(duì)ORSV 的保守外殼蛋白（CP）基因設(shè)計(jì)了 4 條特異性引物，建立了檢測ORSV的 RT-LAMP 方法，利于向基層檢驗(yàn)部門推廣。

1?材料與方法

1.1?供試材料

試驗(yàn)于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉育種科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。感染建蘭花葉病毒Cymbidium mosaic virus（CyMV）、齒蘭環(huán)斑病毒Odontoglossum ringspot virus（ORSV）、菜豆黃花葉病毒Bean yellow mosaic virus（BYMV）、小蒼蘭花葉病毒Freesia mosaic virus（FreMV）、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）的陽性樣品及健康對(duì)照樣品的葉片均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。熒光染料 SYBR GreenⅠ購自北京鼎國公司;Bst 聚合酶、MgSO4購自New England Biolabs（美國）;RNAiso Plus購自 TaKaRa;甜菜堿購自Sigma（美國）;Trizol購自TaKaRa。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?RT-LAMP 體系的建立?取待測樣品的葉片，按照Trizol方法提取樣品的總RNA。根據(jù) GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 公布的ORSV較保守的 CP 基因序列為靶標(biāo)基因（HQ644131）， 設(shè)計(jì)得到 6 個(gè)特定區(qū)域的 4 條特異性引物，其中 F3和 B3 為外引物、FIP 和 BIP 為內(nèi)引物（表 1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10× Bst buffer、4 μL MgSO4（25 mmol·L-1）、4 μL Betaine（5 mmol · L-1）、 4 μL dNTPs（2.5 mmol · L-1）、1 μL Bst 聚合酶（8 U · μL-1）、2 μL FIP（20 μmo·L-1）、2 μL BIP（20 μmol·L-1）、0.5 μL F3（10 μmol · L-1）、0.5 μL B3（10 μmol · L-1）、2 μL ddH2O、2.5 μL cDNA（50 ng·μL-1）。反應(yīng)條件為：65℃ 60 min，80℃ 5 min。反應(yīng)產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析;或在PCR管蓋上加入2 μL的1 000×SYBR GreenⅠ，混勻后目視觀察結(jié)果。RT-LAMP 結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后，在不開蓋的情況下離心反應(yīng)管，使染色劑與擴(kuò)增產(chǎn)物混合，肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果，或取 10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad SYSTEM GelDoc XR+）上觀察并記錄結(jié)果。

1.2.2?RT-LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切驗(yàn)證?為了進(jìn)一步驗(yàn)證 LAMP 擴(kuò)增的正確性，在設(shè)計(jì)LAMP 引物時(shí)引入了 EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)。將LAMP產(chǎn)物電泳，梯形條帶進(jìn)行膠回收，再用 EcoR Ⅰ酶37℃酶切過夜，連接于PMD18-T載體上，用 JOM109 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，測序。

1.2.3?RT-LAMP特異性驗(yàn)證和靈敏度檢測?分別提取感染CyMV、BYMV、FreMV、CMV、ORSV的陽性樣品的總RNA，采用 RT-LAMP技術(shù)進(jìn)行特異性檢測。以感染ORSV樣品的總RNA為基本模板（160 ng·μL-1），進(jìn)行 10-1、10-2、 10-3、 10-4、 10-5倍梯度稀釋， 分別進(jìn)行RT-LAMP 和 RT-PCR靈敏度檢測。

1.2.4?田間樣品檢測?應(yīng)用本研究建立的 RT-LAMP 和 RT-PCR技術(shù)，對(duì)田間隨機(jī)采集的10份建蘭和 10 份文心蘭樣品進(jìn)行檢測和驗(yàn)證。

2?結(jié)果與分析

2.1?RT-LAMP 體系的建立

通過反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了能擴(kuò)增ORSV的 RT-LAMP 反應(yīng)體系（圖 1），RT-LAMP陽性反應(yīng)產(chǎn)物梯形的條帶，陰性對(duì)照未發(fā)現(xiàn)條帶;在產(chǎn)物中加入 SYBR GreenⅠ，混勻，ORSV RT-LAMP陽性反應(yīng)產(chǎn)物顏色為黃綠色，陰性對(duì)照為橙色。

2.2?RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切驗(yàn)證

將LAMP產(chǎn)物膠回收后，用EcoRⅠ酶切如圖2，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化測序，最終得出，酶切出的片段為目標(biāo)基因F2-B2的序列，包括酶切堿基在內(nèi)大小為165 bp。證明該體系擴(kuò)增產(chǎn)物為靶基因。

2.3?RT-LAMP特異性驗(yàn)證和靈敏度檢測

以分別感染 CyMV、BYMV、FreMV、CMV和ORSV的樣品總RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP 擴(kuò)增。如圖3所示，只有ORSV有梯狀條帶，檢測結(jié)果為陽性，其他樣品不產(chǎn)生條帶， 說明建立的檢測體系對(duì)ORSV檢測有較好特異性。

對(duì)不同濃度稀釋后的RNA，分別進(jìn)行 RT-LAMP 和 RT-PCR 反應(yīng)。結(jié)果顯示，RT-LAMP在稀釋 1 000倍時(shí)，仍能檢測出 ORSV，而RT-PCR 在稀釋1 000倍時(shí)，未能檢出ORSV（圖 4），表明 RT-LAMP 檢測 ORSV 的靈敏度比 RT-PCR 提高了10 倍。

2.4?田間樣品檢測

隨機(jī)采取建蘭和文心蘭樣品各10 份，分別進(jìn)行RT-LAMP 和 RT-PCR檢測，結(jié)果顯示， 兩者檢測結(jié)果一致，建蘭有4份樣品呈陽性， 文心蘭有2份樣品呈陽性（表 2），表明 RT-LAMP 檢測技術(shù)能應(yīng)用于田間樣品。

3?討論與結(jié)論

蘭花是中國四大名花之一，代表高貴、典雅，具有極高的觀賞和收藏價(jià)值。但當(dāng)病毒病侵染時(shí)，植株會(huì)出現(xiàn)畸形、壞死，從而造成品質(zhì)下降，這是制約蘭花大規(guī)模生產(chǎn)的重要因子。為滿足消費(fèi)需求，培育無病毒苗是防止病毒病的重要措施，因此，建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法，對(duì)阻止病毒病的傳播有良好作用;或?qū)γ摱久邕M(jìn)行檢測，從根源上預(yù)防病毒病也具有重要意義。本試驗(yàn)針對(duì)齒蘭環(huán)斑病毒建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有擴(kuò)增快速高效、特異性好、操作簡便、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，可以針對(duì)性地對(duì)蘭花脫毒種苗進(jìn)行檢測，從種源遏制病毒病的發(fā)生。本研究技術(shù)具有較高的應(yīng)用價(jià)值，在基層和現(xiàn)場檢測中有很好的應(yīng)用前景。

目前，病毒檢測的常用方法是 PCR和酶聯(lián)免疫技術(shù)，均具有較好的檢測效果，但存在耗時(shí)長，成本高的特點(diǎn)，不適用于基層檢測。與常規(guī) PCR 方法相比，本研究建立的 LAMP 技術(shù)，在保持 PCR 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，不需要特殊儀器，操作簡單，不需要熱循環(huán)，整個(gè)過程可以在 60 min 內(nèi)完成，更加省時(shí)。檢測結(jié)果采用加入 SYBR GreenⅠ目測的方式，檢測更快捷方便，因此該方法特別適合在基層中應(yīng)用。

LAMP 技術(shù)使用 4～6 條引物，會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)反應(yīng)的特異性[12-13]。引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，也較復(fù)雜和困難，除要遵循一般引物設(shè)計(jì)原則外，LAMP 引物設(shè)計(jì)自身要注意的事項(xiàng)[14]，特別是對(duì)于 GC 含量較高序列或較短序列設(shè)計(jì)更加困難[15]。本試驗(yàn)針對(duì)齒蘭環(huán)斑病毒CP基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)驗(yàn)證該引物的特異性良好。同時(shí)，本研究建立的檢測ORSV的RT-LAMP方法特異性強(qiáng)，用時(shí)短，操作簡單，靈敏度較高，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍，對(duì)于病毒含量很少的脫毒苗的快速檢測方面也有一定的優(yōu)勢(shì)。LAMP 方法靈敏度高，容易出現(xiàn)假陽性，因此本研究采用在 RT-LAMP 反應(yīng)管蓋上滴加 SYBR green I 染色劑，待反應(yīng)結(jié)束后在不開蓋的情況下直接使染色劑與擴(kuò)增產(chǎn)物混合，以此減少反復(fù)開蓋而造成的污染問題。

參考文獻(xiàn)：

[1]HU J S， FERREIRA D， WANG M， et al. Detection of cymbidium mosaic virus， odontoglossum ringspot virus， tomato spotted wilt virus， and potyviruses infecting orchids in Hawai[J]. Plant Disease， 1993， 77：464-468.

[2]WONG S M， CHENG C G， LEE Y H， et al. Incidence of cymbidium mosaic and odontoglossum ringspot viruses and their significance in orchid cultivation in Singapore[J]. Crop Protection， 1994， 13：235-239.

[3]ZETTLER F W， KO N J， WISLER G C， et al. Viruses of orchids and their control[J]. Plant Disease， 1990， 74（9）：621-626.

[4]MENZEL W， JELKMANN W， MAISS E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control[J]. Journal of Virological Methods， 2002， 99：81-92.

[5]THOMPSON J R， WETZEL S， KLERKS M M， et al. Multiplex RT-PCR detection of four aphid-borne strawberry viruses in Fragaria spp. in combination with a plant mRNA specific internal control[J]. Journal of Virological Methods， 2003， 111（2）：85-93.

[6]梁敏國， 劉光華. 廣東蘭花病毒病調(diào)查和病原檢測[J]. 江西植保， 2004， 27（3）：97-100.

LIANG M G， LIU G H. Research and Pathogeny Identification on Virus Disease of Orchid in Guangdong Province[J]. Jiangxi Plant Protection， 27（3）：97-100.（in Chinese）

[7]柳愛春，趙蕓，劉超，等. 雙重一步法RT-PCR檢測2種主要蘭花病毒[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（27）：12960-12961， 13009.

LIU A C， ZHAO Y， LIU C， et al. Detection of Two Main Orchid Viruses with the Method of Double One-step RT-PCR[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2009， 37（27）：12960-12961， 13009.（in Chinese）

[8]NOTOMI T， OKAYMA H， MASUBUCHI H. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research， 2000， 28（12）：63.

[9]HARPER S J， WARD L I， CLOVER G R. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications[J]. Phytopathology， 2010， 100（12）：1282-1288.

[10]RANJAN R， KANJAYAN M， SUBRAMANIAM S， et al. Development and evaluation of a one-step reverse transcription-loop mediated isothemal amplication assay（RT-LAMP） for rapid detection of foot and mouth disease virus in India[J]. Virus Disease， 2014， 25（3）：358-364.

[11]SINGH P， MIRDHA B R， AHUJA V， et al. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP） assay for rapid detection of Entamoeba histolytica in amoebic liver abscess[J]. World Microbiol Biotechnol， 2013， 29：27-32.

[12]高宏偉，徐彪，朱來華，等. 應(yīng)用LAMP檢測方法檢測肉制品中的單增李斯特菌[J]. 食品安全質(zhì)量檢測技術(shù)， 2010， 27（1）：12-17.

GAO H W， XU B， ZHU L H， et al. Detection of Listeria monocytogenes in meat by loop-mediated isothermal amplification （LAMP）[J]. Journal of Food Safety and Quality， 2010， 27（1）：12-17.（in Chinese）

[13]ZHANG Y Q， SHAN X X， SHI L， et al. Development of a fim Y-based loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Salmonella in food[J]. Food Research international， 2012， 45（2）：1011-1015.

[14]王永，蘭青闊，趙新，等. 轉(zhuǎn)基因作物外源轉(zhuǎn)基因成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 42（4）：1473-1477.

WANG Y， LAN Q K， ZHAO X， et al. Development and Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Genetically Modified Crops[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2009， 42（4）：1473-1477.（in Chinese）

[15]CHEN L， GUO J， WANG Q， et al. Development of the visual loop-mediated isothermal amplification assay for seven genecitally modified maize events and their application in practical samples analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2011， 59（11）：5914-5918.

（責(zé)任編輯：林海清）