易亞喬 何清湖 劉檢 劉林 成紹武 廖君 王國佐 譚琥 劉吉勇 陳俊煒 郭艷幸 葛金文

〔摘要〕 目的 探討加味腦泰方（以下簡稱JWF）對血管性癡呆（vascular dementia， VD）大鼠SIRT1/NF-κB p56炎性通路的調(diào)控作用。方法 采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法（two-vessel occlusion， 2-VO）復(fù)制VD大鼠模型。實驗設(shè)正常組，假手術(shù)組，模型組，JWF高、中、低劑量組和奧拉西坦組，其中JWF高、中、低劑量組和奧拉西坦組分別灌胃給予JWF17.0、34.0、51.0 g/kg和奧拉西坦0.216 g/kg，其余3組灌服等容量蒸餾水，連續(xù)干預(yù)30 d。采用Morris水迷宮、HE染色分別檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織病理形態(tài)變化;采用免疫組化檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子-1（silent informatio regulator-1， SIRT1）、核因子κB抑制蛋白d亞基（The nuclear factorκB inhibits theprotein subunit， IκBα）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B， NF-κB）蛋白表達情況。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低（P<0.05），海馬神經(jīng)元變性、壞死，炎性細(xì)胞浸潤增加，且SIRT1、IκBα表達下調(diào)，NF-κB p56表達上調(diào)（P<0.05）;與模型組比較，奧拉西坦組和JWF高、中劑量組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著增強（P<0.05），海馬組織中神經(jīng)元錐體細(xì)胞排列較整齊，輪廓清晰，炎性細(xì)胞浸潤顯著減少，且海馬組織內(nèi)SIRT1、IκBα表達上調(diào)，NF-κB p56表達下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 JWF對血管性癡呆大鼠炎性相關(guān)信號通路SIRT1/NF-κB p56具有明顯的調(diào)控作用，這可能是其保護VD大鼠海馬神經(jīng)元繼而改善學(xué)習(xí)記憶能力的重要機制之一。

〔關(guān)鍵詞〕 加味腦泰方;血管性癡呆;海馬組織;沉默信息調(diào)節(jié)因子-1;核因子κB抑制蛋白d亞基;核因子-κB

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.002

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effects of Jiawei Naotai Formula （JWF） on inflammatory pathway of SIRT1/NF-κB p56 in rats with vascular dementia （VD）. Methods The model of VD rats was established by bilateral common carotid artery ligation assay （two-vessel occlusion， 2-VO）. There were normal group， sham operation group， model group， JWF groups of high， moderate and low dose， as well as oxiracetam group in this experiment. The JWF groups of high， moderate and low dose， and the oxiracetam group were given 17.0， 34.0 and 51.0 g/kg Jiawei Naotai Formula and 0.216 g/kg oxiracetam respectively， while the other 3 groups were given the same amount of distilled water， for 30 d of consecutive intervention. The learning and memory ability and the pathological morphology changes of hippocampal tissue of rats were detected by Morris water maze and HE staining， respectively. The protein expressions of SIRT1， IκBα and NF-κB were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， the learning and memory ability of rats in the model group was obviously decreased （P<0.05）; degeneration and necrosis of hippocampal neurons was detected and inflammatory cell infiltration was increased; the expressions of SIRT1 and IκBα were decreased， while that of NF-κB p56 was increased （P<0.05）. Compared with the model group， the learning and memory ability of rats in the oxiracetam group and the JWF groups of high， moderate and low dose were notably improved （P<0.05）; the neuron pyramidal cells in the hippocampal tissue were more orderly arranged with clear outlines， and inflammatory cell infiltration was obviously decreased; the expressions of SIRT1 and IκBα was increased， while that of NF-κB p56 was decreased （P<0.05）. Conclusion There are significant regulatory effects of JWF on inflammatory pathway of SIRT1/NF-κB p56 in rats with vascular dementia， which may be one of the important mechanisms for protecting hippocampal neurons of VD rats and subsequently improving the learning and memory ability.

〔Keywords〕 Jiawei Naotai Formula; vascular dementia; hippocampal tissue; SIRT1; IκBα; NF-κB

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指各種腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征[1]，且其發(fā)病機制依舊未明。目前，臨床治療VD主要從改善認(rèn)知功能紊亂及保護腦細(xì)胞等方面著手[2-3]，西藥療效不佳。研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)因子-1（silent information regulator-1， SIRT1）在調(diào)控細(xì)胞衰老、代謝紊亂等方面發(fā)揮著重要作用[4]，另SIRT1 mRNA在海馬神經(jīng)元具有豐富表達，其能通過抗炎效應(yīng)而減輕缺血缺氧性腦損傷，而炎癥反應(yīng)在血管癡呆等慢性腦缺血后的繼發(fā)性神經(jīng)損傷疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，由此推測SIRT1可能是VD的重要防治靶點。加味腦泰方（以下簡稱JWF）由黃芪、川芎、遠(yuǎn)志等七味藥組成。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，JWF能有效改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并顯著抑制炎性因子（nuclear factor-kappa B， NF-κB）的表達[5-6]。因此，本文擬采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法（two-vessel occlusion， 2-VO）復(fù)制大鼠血管性癡呆模型，同時基于SIRT1/NF-κB p56炎性通路進一步探討JWF對VD大鼠的保護作用及潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠50只，5～6周齡，體質(zhì)量220～240 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2013-0004。

1.2? 藥物與試劑

JWF由黃芪、當(dāng)歸、地龍、川芎、三七、石菖蒲、遠(yuǎn)志組成，中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。JWF大鼠等效劑量為17.01 g/kg。奧拉西坦膠囊，購自石藥集團，大鼠臨床等效劑量為0.216 g/kg。兔抗大鼠多克隆抗體SIRT1、核因子κB抑制蛋白d亞基（The nuclear factorκB inhibits theprotein subunit， IκBα）、NF-κB p56均購自Proteintech公司（其貨號分別為10268-1-AP、10268-1-AP及10745-1-AP）。

1.3? 主要儀器

MT-200型Morris水迷宮（成都泰盟科技有限公司）;Motic B5型圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪公司）。

1.4? 動物造模、分組及干預(yù)

50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機選取44只，其中6只大鼠僅游離雙側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎，作為假手術(shù)組大鼠，其余38只參照文獻方法[7]采用2-VO法復(fù)制VD大鼠模型，術(shù)后24 h合計3只大鼠死亡。采用Morris水迷宮試驗剔除造模后不合格大鼠（即逃避潛伏期小于5 s或大于120 s），經(jīng)篩選后有5只大鼠不符合模型標(biāo)準(zhǔn)，最后將6只正常大鼠、6只假手術(shù)大鼠及造模成功的30只模型大鼠分為正常組，假手術(shù)組，模型組，JWF高、中、低劑量組和陽性藥組，其中JWF高、中、低劑量組和陽性藥組大鼠分別灌胃給予17.0、34.0、51.0 g/kg JWF和0.216 g/kg奧拉西坦，其余3組灌服等容量蒸餾水，連續(xù)干預(yù)30 d。

1.5? 學(xué)習(xí)記憶能力檢測

采用Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，主要步驟如下：連續(xù)訓(xùn)練大鼠5 d，于第6天撤走水面平臺，將大鼠分別從4個象限放入水中，采用Motic B5型圖像分析系統(tǒng)記錄120 s內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)，并將其作為學(xué)習(xí)記憶能力的體現(xiàn)指標(biāo)。

1.6? 海馬組織病理學(xué)檢測

采用HE染色檢測大鼠海馬組織病理學(xué)變化，各組大鼠海馬組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水等操作后，切片，染色，最后在顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.7? SIRT1、IκBα、NF-κB p56蛋白檢測

采用免疫組化檢測大鼠海馬組織中SIRT1、NF-κB p56、IκBα蛋白表達情況。各組大鼠海馬組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、切片脫蠟、3%雙氧水處理、修復(fù)抗原等操作后，加入一抗（1∶200）4 °C過夜，然后加入HRP-IgG二抗（1∶400），最后經(jīng)顯色、脫水、封片等操作后，于光鏡下隨機取5個視野，采用Motic圖像分析系統(tǒng)測定其平均灰度值，其中灰度值越小，提示蛋白陽性表達量越高。

1.8? 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示，采用SPFF 16.0軟件，通過One-Way ANOVA檢驗，比較各組間的顯著性差異，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? JWF對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗，模型組大鼠跨越平臺次數(shù)明顯減少（P<0.05）;與模型組比較，奧拉西坦組及JWF高、中劑量組大鼠跨越平臺次數(shù)顯著增加（P<0.05），經(jīng)藥物干預(yù)后大鼠記憶能力均有一定改善。見表1。

2.2? JWF對VD大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬神經(jīng)元變性、壞死（如箭頭所示），炎性細(xì)胞浸潤增加;與模型組比較，奧拉西坦組及JWF各劑量組大鼠海馬神經(jīng)元錐體細(xì)胞排列較整齊，輪廓清晰，炎性細(xì)胞浸潤顯著減少。見圖1。

2.3? JWF對VD大鼠炎性通路SIRT1、IκBα、NF-κB p56蛋白表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，SIRT1、NF-κB p56、IκBα蛋白陽性表達呈棕黃色或棕褐色。結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中SIRT1、IκBα陽性表達降低，NF-kB p56陽性表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，奧拉西坦組及JWF高、中劑量組大鼠海馬組織中SIRT1、IκBα陽性表達增加，NF-kB p56陽性表達顯著減少（P<0.05），見表2、圖2-4。

3 討論

VD是指各種腦血管疾病所致的學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能紊亂綜合征，臨床特點為遇事易忘、情緒失調(diào)、理解錯誤等。目前VD發(fā)病機制不明，研究發(fā)現(xiàn)其與腦缺血缺氧，繼而引起的特定神經(jīng)組織損害息息相關(guān)，因此慢性腦缺血缺氧可能是探究VD發(fā)病機制的有效途徑。既往研究表明，雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法（2-VO法）能促使海馬、皮層等腦組織產(chǎn)生缺血缺氧性損傷，繼而誘發(fā)VD[8]，且該法操作簡便、重現(xiàn)性佳，現(xiàn)已被廣泛用于VD研究[9]。

SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?；?，其涉及機體DNA損傷修復(fù)、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，敲除SIRT1后，海馬神經(jīng)元突觸可塑性明顯降低，小鼠學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知能力顯著下降[10-12]。SIRT1/NF-κB信號通路參與了VD病理機制的炎癥過程，當(dāng)VD發(fā)生時，SIRT1促進下游信號NF-κB亞基RelA/p65去乙?；?，抑制其轉(zhuǎn)錄活性而調(diào)控炎癥。IκBα是NF-κB抑制因子，炎癥發(fā)生時前者磷酸化，并促使后者轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，進而激活炎癥反應(yīng)[13]。此外，SIRTl還可直接乙?；疦F-κB p65，同時抑制IκBα磷酸化，進而減少炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生，防止炎癥引起的神經(jīng)元損傷[14]。本文采用2-VO法復(fù)制VD大鼠模型，并予以JWF干預(yù)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，海馬錐體細(xì)胞明顯受損，炎性細(xì)胞浸潤增加，炎性通路相關(guān)蛋白SIRT1、IκBα表達明顯降低、NF-κB p56表達明顯增加，而給予JWF干預(yù)后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，海馬神經(jīng)元錐體細(xì)胞排列較整體，輪廓清晰，炎性細(xì)胞浸潤顯著減少，SIRT1、NF-kB和IκBα蛋白表達異常被明顯逆轉(zhuǎn)，這提示JWF可能是通過調(diào)控SIRT1/NF-κB p56信號通路保護海馬神經(jīng)元繼而改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

VD屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”“善忘”等范疇[15]，其為本虛標(biāo)實之病，本虛為氣血虧虛，標(biāo)實為痰瘀阻絡(luò)，年老氣衰，氣虛行血無力，瘀阻腦絡(luò)則發(fā)為癡呆，基本病機特點可用“虛、瘀、痰”來概括。加味腦泰方經(jīng)補陽還五湯加減而成，由黃芪、川芎、當(dāng)歸、石菖蒲、遠(yuǎn)志、地龍、三七組成，方中黃芪為君、當(dāng)歸為臣，佐以川芎、地龍等，全方共奏益氣活血、化痰祛瘀之功效。我們前期發(fā)現(xiàn)腦泰方具有抗血栓、抗炎等作用，能明顯保護缺血缺氧腦組織[16]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖、三七皂苷等具有明顯的抗炎、抗氧化、改善腦缺血及VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能[17]。本文結(jié)果亦再次佐證了調(diào)控炎性通路可有效保護海馬神經(jīng)元繼而改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，JWF對VD大鼠SIRT1/NF-κB p56炎性通路具有明顯的調(diào)控作用，這可能是其保護海馬神經(jīng)元繼而抗血管性癡呆的重要機制之一，后續(xù)實驗我們將以SIRT1上下游的關(guān)鍵靶點為核心，并輔以受體阻斷劑與激動劑，進一步闡明加味腦泰方對血管性癡呆大鼠的深層保護機制。

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