蔣云霞 陳文輝 李雙蕾 覃俏娜 陳薇宇

〔摘要〕 目的 探討益氣養(yǎng)陰清熱方對(duì)自發(fā)性2型糖尿?。↘KAy）小鼠胰高血糖素樣肽2（glucagon-like peptide 2， GLP-2）、γ干擾素（interferon gamma， IFN-γ）、核因子κB（nuclear factor kappa beta， NF-κB）的影響。方法 取雄性SPF級(jí)KKAy小鼠50只，隨機(jī)分為模型組，二甲雙胍組，益氣養(yǎng)陰清熱方高、中、低劑量組，每組各10只;另取10只C57BL/6J小鼠作為正常組。各組予以相應(yīng)干預(yù)。干預(yù)8周后檢測各組小鼠GLP-2、IFN-γ、NF-κB水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠IFN-γ、NF-κB明顯升高（P<0.01），GLP-2水平明顯降低（P<0.01）。益氣養(yǎng)陰清熱方高、中、低劑量組均可降低KKAy小鼠IFN-γ水平（P<0.05）;益氣養(yǎng)陰清熱方高劑量組可降低小鼠NF-κB水平（P<0.05）;益氣養(yǎng)陰清熱方高、中、低劑量組均可升高小鼠GLP-2水平（P<0.05）。結(jié)論 益氣養(yǎng)陰清熱方能改善糖尿病小鼠血糖、胰島素抵抗，其作用可能與提高GLP-2水平、降低炎癥反應(yīng)相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病;益氣養(yǎng)陰清熱;胰高血糖素樣肽2;γ干擾素;核因子κB

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R255.4? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Yiqi Yangyin Qingre Formula on glucagon-like peptide 2 （GLP-2）， interferon-gamma （IFN-γ） and nuclear factor kappa B （NF-κB） in spontaneous type 2 diabetes （KKAy） mice. Methods A total of 50 male SPF KKAy mice were selected. They were randomly divided into a model group， a metformin group， as well as high， medium and low dose groups of Yiqi Yangyin Qingre Formula， with 10 mice in each group. And 10 C57BL/6J mice were taken as the normal group. Each group was given corresponding intervention. After 8 weeks of intervention， the levels of GLP-2， IFN-γ and NF-κB of mice were measured. Result Compared with the normal group， the levels of IFN-γ and NF-κB in the model group were increased significantly （P<0.01）， and the GLP-2 level was decreased significantly （P<0.01）. The IFN-γ level of KKAy mice could be decreased in the high， medium and low dose groups of Yiqi Yangyin Qingre Formula （P<0.05）. The NF-κB level of mice could be decreased in the high dose group of Yiqi Yangyin Qingre Formula （P<0.05）. And the GLP-2 level of mice could be increased in the high， medium and low dose groups of Yiqi Yangyin Qingre Formula （P<0.05）. Conclusion Yiqi Yangyin Qingre Formula can reduce blood glucose and insulin resistance in diabetic mice， and its effects may be related to the increase of GLP-2 level and the reduction of inflammatory reaction.

〔Keywords〕 diabetes mellitus; Yiqi Yangyin Qingre; glucagon-like peptide 2; interferon-gamma; nuclear factor-kappa B

2型糖尿病發(fā)病早期多存在胰島素抵抗，研究表明，炎癥因子與糖尿病胰島素抵抗存在明顯相關(guān)[1]，但是此慢性炎癥的啟動(dòng)基點(diǎn)尚不清楚。進(jìn)一步研究表明，腸黏膜屏障損傷可能是炎癥啟動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而胰高血糖素樣肽2（glucagon-like peptide 2，GLP-2）有維持腸黏膜屏障功能的作用，GLP-2同時(shí)與糖代謝及胰島素抵抗也存在密切關(guān)系[2-5]。益氣養(yǎng)陰清熱方是廣西名中醫(yī)李雙蕾教授的經(jīng)驗(yàn)方，既往研究已經(jīng)證實(shí)其可改善血糖及胰島素抵抗[6]，有效降低2型糖尿病患者的炎癥因子水平[7]。前期實(shí)驗(yàn)研究已表明益氣養(yǎng)陰清熱方能改善糖尿病小鼠胰島素抵抗，降低空腹及隨機(jī)血糖，其機(jī)制可能是通過抑制炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)[8]。本研究在此基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步觀察益氣養(yǎng)陰清熱方對(duì)KKAy小鼠GLP-2、γ干擾素（interferon gamma， IFN-γ）、核因子κB（nuclear factor kappa beta， NF-κB）的影響，探討其可能通過改善腸道黏膜屏障，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)、改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

SPF級(jí)5周齡雄性自發(fā)性2型糖尿病（KKAy）小鼠50只，5周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠10只，體質(zhì)量均為19～33 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（桂）2014-0003。

1.2? 藥物與試劑

益氣養(yǎng)陰清熱方（由生黃芪30 g，黃連9 g，知母20 g，麥冬20 g，連翹9 g，淮山藥20 g組成），單味中藥濃縮顆粒劑，江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1611021。鹽酸二甲雙胍片：上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1660706;0.9%氯化鈉注射液：山東康寧藥業(yè)有限公司，批號(hào)：A16031901。

血糖試紙：羅氏卓越型血糖儀試紙，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司。小鼠血清胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）測定ELISA試劑盒、小鼠胰GLP-2測定ELISA試劑盒、小鼠IFN-γ測定ELISA試劑盒、小鼠NF-κB測定ELISA試劑盒，均由武漢華美生物工程有限公司提供。

1.3? 儀器

ACCU-CHEK Performa Nano血糖儀，德國羅氏;T-5000型電子天平，國雙杰兄弟（集團(tuán)）;Eppendorf5840R冷凍高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司;型號(hào)5810R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司;型號(hào)Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)，美國Thermo;Aeroset全自動(dòng)生化分析儀，日本TOSHIBA公司;MK3酶標(biāo)儀，芬蘭Labsystems Multiskan。

2 方法

2.1? 造模與干預(yù)

KKAy小鼠及C57BL/6J小鼠5周齡，以普通全價(jià)顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，KKAy小鼠改為高脂飼料（成分：粗蛋白17.98%，粗纖維4.45%，粗脂肪19.42%，粗灰分7.42%，水分8.98%，碳水化合物48.47%）喂養(yǎng)2周;尾靜脈取血測隨機(jī)血糖≥13.9 mmol/L[9]，且維持72 h，為造模成功。將造模成功KKAy小鼠隨機(jī)分為模型組，二甲雙胍組，益氣養(yǎng)陰清熱方高、中、低劑量組（以下簡稱為中藥高、中、低劑量組），每組10只;另取C57BL/6J小鼠10只作為正常組。按二甲雙胍組（0.2 g/kg）、中藥高劑量組（2 g/kg）、中藥中劑量組（1 g/kg）、中藥低劑量組（0.5 g/kg）灌胃，灌胃容積0.5 mL。模型組、正常組：灌服等體積0.9%生理鹽水。干預(yù)周期為8周。

2.2? 觀察指標(biāo)與檢測

于連續(xù)用藥8周后，停藥，禁食不禁水12 h，眶靜脈取血，靜置2～3 h后，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，分裝，-20 ℃保存，采用ELISA法測定GLP-2、IFN-γ、NF-κB水平。

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件分析，計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 對(duì)糖尿病小鼠IFN-γ、NF-κB水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠IFN-γ、NF-κB水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，中藥高、中、低劑量組均可降低IFN-γ水平（P<0.05），其作用與二甲雙胍組相當(dāng)（P>0.05）。中藥高劑量組可降低NF-κB水平（P<0.05），而中藥中、低劑量組及二甲雙胍組作用并不明顯（P>0.05）。見表1。

3.2? 對(duì)糖尿病小鼠GLP-2水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠GLP-2水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，中藥高、中、低劑量組均可升高GLP-2水平（P<0.05），中藥高、中劑量組其作用與二甲雙胍組相當(dāng)（P>0.05）。見表1。

4 討論

2型糖尿病是一種以胰島素抵抗為主要機(jī)制的內(nèi)分泌代謝性疾病。近年來對(duì)糖尿病胰島素抵抗機(jī)制的研究表明，IFN-γ、NF-κB等多種炎癥因子參與到了胰島素抵抗的過程中[8，10-12]，胰島素抵抗是一種慢性炎癥過程。而在此過程中慢性炎癥是如何啟動(dòng)的仍需要進(jìn)一步研究。

正常狀態(tài)下，腸道中含有大量潛在的內(nèi)毒素和致病菌，而完整健康的腸黏膜屏障可以有效地防止腸道內(nèi)的內(nèi)毒素和細(xì)菌進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)機(jī)體形成天然的保護(hù)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。一旦這種平衡狀態(tài)被打破，發(fā)生菌群失調(diào)，細(xì)菌及其毒素就可能通過啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，破壞腸黏膜屏障功能，進(jìn)而導(dǎo)致全身的慢性炎癥反應(yīng)，參與肥胖和胰島素抵抗進(jìn)程[13]。

而在維持腸黏膜屏障功能中GLP-2起到至關(guān)重要的作用。GLP-2被認(rèn)為是一種生理狀態(tài)下的腸道營養(yǎng)因子，特異性地作用于腸道的黏膜、黏膜下和肌間神經(jīng)元、柱狀上皮的祖細(xì)胞，促進(jìn)柱狀上皮細(xì)胞增生和營養(yǎng)底物吸收，加速包括內(nèi)分泌細(xì)胞在內(nèi)的整個(gè)腸隱窩部細(xì)胞群的分化、生長和修復(fù)，從而增加小腸的重量、蛋白質(zhì)的合成、絨毛的高度和隱窩深度，降低腸道通透性[2，14]。同時(shí)，GLP-2亦屬于胰高血糖素原衍生肽類，是胰高血糖素原基因的表達(dá)產(chǎn)物之一，有研究顯示，GLP-2可通過促進(jìn)腸道葡萄糖吸收調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[2]，肥胖患者體內(nèi)GLP-2水平與胰島素敏感指數(shù)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系[3]，同時(shí)，敲除中樞 GLP-2受體的大鼠葡萄糖耐量減低，并且表現(xiàn)出胰島素抵抗，而中樞輸注GLP-2可改善血糖[4]。2型糖尿病大鼠腸黏膜屏障受損，GLP-2水平也隨之下降[5]。因此，GLP-2在維持腸道屏障功能，抑制炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗方面具有重要作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病屬“消渴”“消癉”等范疇[15]，許多學(xué)者也從“虛”“熱”論治其重要性[16]?！蹲C治要訣·三消》曰：“三消得之氣之實(shí)，血之虛，久久不治，氣盡虛，則無能為力矣。”因而采用益氣養(yǎng)陰清熱治法在糖尿病治療中具有獨(dú)特療效。

李雙蕾教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，在“氣陰虧虛，熱毒為患”的理論基礎(chǔ)上，精選藥物組成益氣養(yǎng)陰清熱方，該方由生黃芪、黃連、知母、麥冬、連翹、淮山藥組成?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》談到黃芪可“補(bǔ)丈夫虛損，五勞羸瘦，止渴，腹痛泄痢，益氣，利陰氣”，故以黃芪為君，補(bǔ)中益氣，脾氣健旺，則水道通調(diào);山藥健脾補(bǔ)肺，固腎益精，黃連清熱解毒，燥濕堅(jiān)陰，二者為臣;知母瀉三焦虛火，麥冬養(yǎng)陰除煩，滋養(yǎng)匱乏之胃陰，二者相和，養(yǎng)陰清熱而共為佐藥;連翹清熱解毒，散結(jié)消腫，一清熱毒，二防補(bǔ)益太過，聚而為毒，為佐使之用。全方共奏益氣養(yǎng)陰，清熱解毒之效。

本研究結(jié)果顯示，KKAy小鼠血清中的IFN-γ、NF-κB明顯升高，說明胰島素抵抗糖尿病小鼠處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)，與課題組以往研究結(jié)果一致。而益氣養(yǎng)陰清熱方能夠降低IFN-γ、NF-κB水平，說明其具有抑制低度炎癥的作用。同時(shí)研究結(jié)果顯示，KKAy小鼠血清中的GLP-2水平明顯降低，說明胰島素抵抗糖尿病小鼠的腸道黏膜屏障功能下降。而益氣養(yǎng)陰清熱方可升高小鼠體內(nèi)GLP-2水平，提示益氣養(yǎng)陰清熱方可能通過提高體內(nèi)GLP-2水平，改善腸道黏膜屏障功能，進(jìn)而減少慢性炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗和血糖水平。

參考文獻(xiàn)

[1] BOLAND L， BURAND A J， BROWN A J， et al. IFN-γ and TNF-α Pre-licensing protects mesenchymal stromal cells from the pro-inflammatory effects of palmitate[J]. Molecular Therapy， 2018，26（3）：860-873.

[2] GUAN X， STOLL B， LU X， et al. GLP-2-mediated up-regulation of intestinal blood flow and glucose uptake is nitric oxide-dependent in TPN-fed piglets 1[J]. Gastroenterology， 2003，125（1）：136-147.

[3] GELONEZE B， LIMA M M， PAREJA J C， et al. Association of insulin resistance and GLP-2secretion in obesity： a pilot study[J]. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia， 2013，57（8）： 632-635.

[4] SHI X， ZHOU F G， CHANG? B， et al. Central GLP-2 enhances hepatic insulin sensitivity via activating PI3K signaling in POMC neurons[J]. Cell Metabolism， 2013，18（1）：86-98.

[5] SHAN C Y， YANG J H， KONG Y， et al. Alteration of the intestinal barrier and GLP2 secretion in Berberine-treated Type 2 diabetic rats[J]. Journal of? Endocrinology， 2013， 218（3）： 255-262.

[6] 李雙蕾，陳文輝，陳莉娜，等.益氣養(yǎng)陰清熱方對(duì)初發(fā)2型糖尿病患者胰島素抵抗的影響[J].廣西中醫(yī)藥，2012，35（4）：9-12.

[7] 李雙蕾，陳莉娜，趙? 偉，等.益氣養(yǎng)陰清熱方對(duì)2型糖尿病患者炎癥因子的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（3）：474-748.

[8] 蔣云霞，李雙蕾，陳文輝，等.益氣養(yǎng)陰清熱方對(duì)糖尿病KKAy小鼠血清胰島素及TNF-α、IL-6的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，13（9）：1248-1251.

[9] 劉曉丹，楊? 剛，范秋靈，等.自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型KKAy小鼠腎臟損害的特征與演變[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40（2）：104-106.

[10] SCHMIDT F M， WESCHENFELDER J， SANDER C， et al. Inflammatory cytokines in general and central obesity and modulating effects of physical activity[J]. PloS ONE， 2015， 10（3）：e0121971.

[11] GUZIK T J， SKIBA D S， TOUYZ R M， et al. The role of infiltrating immune cells in dysfunctional adipose tissue[J]. Cardiovascular Research， 2017，113（9）：1009-1023.

[12] KIECHL S， WITTMANN J， GIACCARI A， et al. Blockade of receptor activator of nuclear factor-κB （RANKL） signaling improves hepatic insulin resistance and prevents development of diabetes mellitus[J]. Nature Medicine， 2013，19（3）：358-363.

[13] SHI H， KOKOEVA M V， INOUYE K， et al. TLR4 links innate immunity and fatty acid- induced insulin resistance[J]. The Journal of Clinical Investigation， 2006，116（11）：3015-3025.

[14] CAMERON H L， PERDUE M H. Stress impairs murine intestinal barrier function： improvement by glucagon-like peptide-2[J]. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics， 2005，314（1）：214-220.

[15] 仝小林.糖尿病中醫(yī)藥臨床循證實(shí)踐指南[M].北京：科學(xué)出版社，2016：19.

[16] 張? 翔，喻? 嶸，曾? 婧，等.從“熱”論消渴[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（6）：27-31.