魏林艷 連玲 魏毅東 羅曦 何煒 謝鴻光 謝華安 張建福

摘 要：【目的】探索適合秈稻明恢86多基因遺傳轉(zhuǎn)化的條件，為創(chuàng)制含高產(chǎn)、抗逆、抗蟲(chóng)、抗病等基因的水稻新材料奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳远i稻明恢86為受體材料，將構(gòu)建好的含作物高產(chǎn)基因RRM2、耐旱基因 HS1、抗除草劑基因EPSPS、抗蟲(chóng)基因Bt、細(xì)胞凋亡抑制基因iap和促細(xì)胞再生基因p35等多基因載體（載體分別命名為P5和P8）進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的受體材料、農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)方式、G418篩選濃度和草甘膦篩選濃度等主要影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，探討其適宜的轉(zhuǎn)化條件。【結(jié)果】受體材料的篩選結(jié)果表明，幼胚的出愈率顯著高于成熟胚，且其愈傷組織狀態(tài)相對(duì)較好;各轉(zhuǎn)化條件的篩選結(jié)果，農(nóng)桿菌侵染濃度OD600為0.4～0.6、侵染時(shí)間15～20 min、共培養(yǎng)2～3 d、培養(yǎng)基上添加無(wú)菌濾紙、G418篩選濃度150 mg·L-1和草甘膦篩選濃度800 mg·L-1是提高轉(zhuǎn)化效率的優(yōu)化條件; PCR分析結(jié)果，多基因載體P5中的GUS基因成功轉(zhuǎn)入秈稻明恢86。【結(jié)論】通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，可使秈稻明恢86愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷率和抗性愈傷率得到顯著提高。

關(guān)鍵詞：基因;遺傳轉(zhuǎn)化;秈稻;明恢86

中圖分類(lèi)號(hào)：S 511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）06-621-09

Abstract：【Objective】Conditions for simultaneous transformation of multiple genes in Indica rice， Minghui 86， were studied to facilitate the development of high yield and resistant breeds.【Method】Two multi-gene vectors designated as P5 and P8 that harbored the high-yield RRM2， drought-tolerant HS1， herbicide-resistant EPSPS， and insect-resistant Bt as well as the apoptosis-inhibiting iap and gene that promotes cell regeneration p35 were transformed to the receptor Minghui 86 using agrobacterium-based transformation methodology. The receptor， callus culture， agrobacterium concentration， infection time， co-culture， and screening concentrations of G418 and glyphosate were evaluated for the selection. 【Result】 Under same culture conditions， the recovery rate of Minghui 86 immature embryos was significantly higher with a better callus quality than that of the mature embryos. The optimal transformation conditions were determinated to be a bacterial concentration of OD600=0.4-0.6， an infection time of 15-20 m， co-culture for 2-3 d with the addition of sterile filter paper in medium， and the screening concentration of G418 at 150 mg·L-1 and of glyphosate at 800 mg·L-1. The PCR detection confirmed that GUS in the polygenic vector P5 was successfully transferred into Indica cv. Minghui 86.【Conclusion】 The optimized culture conditions afforded significantly improved callus and resistance induction rates in Minghui 86.

Key words： gene; genetic transformation;indica rice;Minghui 86

0 引言

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上50%以上的人口以稻米為主食。水稻主要有秈稻和粳稻兩大亞種，栽培面積最大的是秈稻[1]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)成為水稻遺傳改良的重要手段之一[2]。在轉(zhuǎn)基因育種方面，粳稻品種已具有一套高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而秈稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化體系還不穩(wěn)定，其轉(zhuǎn)化效率大概在10%左右[3]。因此，進(jìn)行秈稻品種的多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系研究，探討其適宜的轉(zhuǎn)化條件，對(duì)秈稻分子育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】1986年Baba等[4]采用聚乙二醇（PEG）法將農(nóng)桿菌與水稻原生質(zhì)體融合起來(lái)，得到了一部分能夠合成胭脂堿的胚性愈傷組織，使水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了發(fā)展。1994年Hiei等[5]建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化率高達(dá)28.6%，至此農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化取得了初步成功。1998年，Cheng等[6]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將Bt的基因轉(zhuǎn)入水稻，有效控制了水稻病蟲(chóng)害。1999年，項(xiàng)友斌等[7]將改良的Bt基因cryIA（b）和cryIA（c），分別轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。隨著水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究的深入發(fā)展，在穩(wěn)定的單基因和雙基因轉(zhuǎn)化體系研究的基礎(chǔ)上，人們開(kāi)始嘗試多基因轉(zhuǎn)化。Chen等[8]用基因槍法將14個(gè)含不同基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到水稻中。馮道榮等[9]將含有2～3個(gè)抗真菌基因和2個(gè)抗蟲(chóng)基因的多基因表達(dá)載體混合，利用基因槍法將它們共同導(dǎo)入到水稻胚性愈傷組織中，發(fā)現(xiàn)70%的轉(zhuǎn)基因植株含有6～7個(gè)目的基因。目前，基因槍法雖然在多基因轉(zhuǎn)化方面效果較理想，但基因槍法轉(zhuǎn)化費(fèi)用較高，實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。Ye等[10]利用調(diào)控前維生素 A或胚乳色素體中番茄紅素合成的2個(gè)重要植物酶基因psy和crtI，以及標(biāo)記基因aphⅣ構(gòu)建了3個(gè)表達(dá)載體，借助LBA4404農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻幼胚均獲得胚乳中合成β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因植株，培育了備受關(guān)注的黃金水稻?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在以往的轉(zhuǎn)基因育種中，除了基因槍法外的大多數(shù)方法只能轉(zhuǎn)化1～2個(gè)基因，對(duì)作物改良效果有限。若能在費(fèi)用不是太高的情況下一次性對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效率將顯著提高，不僅省時(shí)省力，還能在獲得轉(zhuǎn)基因材料的同時(shí)獲得多個(gè)目標(biāo)性狀[11-12]。為此，本研究主要從多基因轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化效果的影響因素入手，分別對(duì)多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的受體材料、農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)方式、G418篩選濃度和草甘膦篩選濃度等主要影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，探討其適宜的轉(zhuǎn)化條件。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)秈稻明恢86進(jìn)行多基因遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，期望建立高效、穩(wěn)定的多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，并獲得含高產(chǎn)、抗逆、抗蟲(chóng)、抗病等基因的水稻新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻品種

供試水稻品種為雜交水稻秈型恢復(fù)系明恢86，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 農(nóng)桿菌和載體

農(nóng)桿菌菌株EHA105由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室保存;多基因表達(dá)載體P5、P8 由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王濤教授提供。本研究所用的多基因遺傳轉(zhuǎn)化載體P5和P8，包含有作物高產(chǎn)基因RRM2、耐旱基因HS1、抗除草劑基因EPSPS、抗病蟲(chóng)害基因Bt、細(xì)胞凋亡抑制基因iap和促細(xì)胞再生基因p35等基因。雖然P8載體中包含了P5載體的基因，但是由于兩個(gè)載體的大小不同，對(duì)轉(zhuǎn)化效率也會(huì)造成不同影響。為了對(duì)比兩個(gè)載體的轉(zhuǎn)化效果，本試驗(yàn)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將P5、P8載體分別轉(zhuǎn)化秈稻明恢86。P5、P8載體示意圖如圖1。

1.2 方法

1.2.1 受體材料試驗(yàn)

設(shè)置2個(gè)受體材料處理，即幼胚和成熟胚，每次誘導(dǎo)100粒，做3次重復(fù)試驗(yàn)。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代方法：挑選狀態(tài)良好的明恢86幼胚、成熟胚種子，放入滅菌過(guò)的三角瓶中。在超凈臺(tái)上先用滅菌水沖洗3～4遍，用75%無(wú)水乙醇消毒1～2 min，用20% NaClO溶液消毒20～30 min，再用無(wú)菌水沖洗7～8遍，把種子鋪在無(wú)菌濾紙上吹干。把消毒的種子接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃、光/暗（16 h/8 h）交替培養(yǎng)。將新長(zhǎng)出的亮黃色胚性愈傷組織接到繼代培養(yǎng)基上，每隔14 d繼代培養(yǎng)1次。

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染濃度試驗(yàn)

從-80℃冰箱里取出農(nóng)桿菌菌液，用接種環(huán)蘸取農(nóng)桿菌在LB固體培養(yǎng)基（含50 mg·L-1 Rif和50 mg·L-1Kan）上劃線，把培養(yǎng)皿封口倒扣放在28℃暗培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 d后，肉眼可見(jiàn) LB固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出農(nóng)桿菌。用移液槍吸取適量的AAM液（乙酰丁香酮濃度100 μmol L-1）在長(zhǎng)有農(nóng)桿菌的LB固體培養(yǎng)基上反復(fù)吹打，直到把適量的農(nóng)桿菌菌落沖洗下來(lái)，使農(nóng)桿菌和AAM液混合。設(shè)置5個(gè)農(nóng)桿菌侵染濃度（OD600值分別設(shè)為：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）處理，每個(gè)濃度處理侵染40個(gè)愈傷組織，3次重復(fù)。

1.2.3 侵染時(shí)間試驗(yàn)

采用經(jīng)1.2.2試驗(yàn)篩選出的農(nóng)桿菌侵染濃度OD600值0.4～0.6，將狀態(tài)良好的預(yù)培養(yǎng)愈傷組織挑入農(nóng)桿菌中，侵染時(shí)間梯度設(shè)5、10、15、20、30 min等5個(gè)處理，每個(gè)時(shí)間侵染愈傷組織20個(gè)，3次重復(fù)。在規(guī)定的侵染時(shí)間內(nèi)把愈傷組織從農(nóng)桿菌中取出，并放到滅菌過(guò)的濾紙上吹干，最后轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.4 共培養(yǎng)方式試驗(yàn)

設(shè)置2個(gè)共培養(yǎng)方式處理（在共培養(yǎng)基上加濾紙和不加濾紙），每個(gè)處理培養(yǎng)40個(gè)侵染愈傷，3次重復(fù)。愈傷組織放置于26℃暗培養(yǎng)箱中，觀察2種共培養(yǎng)方式的愈傷組織質(zhì)量和形態(tài)差別，統(tǒng)計(jì)其抗性愈傷組織數(shù)。

1.2.5 共培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)

設(shè)置4個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間處理（1、2、3、4 d），3次重復(fù)。把經(jīng)農(nóng)桿菌侵染過(guò)的愈傷組織，放置于鋪有濾紙的共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1、2、3、4 d后轉(zhuǎn)移到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14 d，統(tǒng)計(jì)其抗性愈傷組織數(shù)。

1.2.6 標(biāo)記草甘膦、G418篩選濃度試驗(yàn)

草甘膦設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度處理：400、600、800、1 000 mg·L-1，G418設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度處理：50、100、150、200 mg·L-1，3次重復(fù)。挑選出狀態(tài)良好的明恢86愈傷組織接到不同處理的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)14 d，觀察愈傷組織生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 受體材料的選擇

本試驗(yàn)采用明恢86的成熟胚和幼胚來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織（圖2），將幼胚和成熟胚接到相同的培養(yǎng)基和環(huán)境中培養(yǎng)，結(jié)果幼胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)2～3 d就能長(zhǎng)出愈傷組織，愈傷組織顏色淡黃，質(zhì)地密實(shí)，生長(zhǎng)形態(tài)良好，出愈率高達(dá)100%。而成熟胚出愈時(shí)間較長(zhǎng)，誘導(dǎo)7～10 d才冒出幼小的愈傷組織，愈傷形態(tài)不及幼胚，出愈率50%。雖然成熟胚的取材不受季節(jié)和環(huán)境的限制，但是如果保存方式不當(dāng)，種子的活性容易喪失，影響出愈率。總之，幼胚長(zhǎng)出愈傷組織的時(shí)間早、生長(zhǎng)旺盛、質(zhì)量狀態(tài)好，且幼胚的出愈率顯著高于成熟胚。因此，以下轉(zhuǎn)化條件試驗(yàn)均采用幼胚作為轉(zhuǎn)化受體材料。

2.2 草甘膦對(duì)明恢86愈傷組織的致死濃度

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織，接到草甘膦質(zhì)量濃度分別為400、600、800、1 000 mg·L-1的篩選培養(yǎng)基上，27℃暗培養(yǎng)14 d后觀察愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖3）。經(jīng)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，400和600 mg·L-1處理的愈傷組織在27℃暗培養(yǎng)14 d后仍繼續(xù)生長(zhǎng)，其大小、質(zhì)地都無(wú)明顯變化，只是顏色稍顯暗黃;800 mg·L-1處理的愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，色澤暗淡;1 000 mg·L-1處理的愈傷組織全部褐化死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明，秈稻明恢86愈傷對(duì)草甘膦敏感性較差，需使用較高的篩選濃度。因此，用P5載體轉(zhuǎn)化明恢86宜采用800 mg·L-1作為草甘膦篩選濃度。

2.3 G418對(duì)明恢86愈傷組織的致死濃度

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的明恢86愈傷組織接到G418質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200 mg·L-1的篩選培養(yǎng)基上，27℃暗培養(yǎng)14 d后觀察愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖4）。經(jīng)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)G418質(zhì)量濃度為50 mg·L-1時(shí)，愈傷組織仍持續(xù)生長(zhǎng);當(dāng)G418質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，愈傷組織局部出現(xiàn)褐化;當(dāng)G418質(zhì)量濃度為150 mg·L-1時(shí)，愈傷組織一邊緩慢生長(zhǎng)，一邊逐漸褐化;當(dāng)G418質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，愈傷組織焦化，無(wú)再生愈傷組織。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)G418質(zhì)量濃度不斷升高，愈傷組織逐漸喪失活力，直至全部褐化死亡。因此，P8載體轉(zhuǎn)化明恢86選擇用G418質(zhì)量濃度150 mg·L-1來(lái)篩選培養(yǎng)抗性愈傷組織。

2.4 農(nóng)桿菌濃度對(duì)愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

農(nóng)桿菌濃度會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，農(nóng)桿菌濃度過(guò)高，農(nóng)桿菌會(huì)大量繁殖，愈傷組織會(huì)被農(nóng)桿菌包裹，甚至造成愈傷組織死亡，影響轉(zhuǎn)化效率。反之，農(nóng)桿菌濃度過(guò)低，農(nóng)桿菌不易吸附在愈傷組織表面，較難得到轉(zhuǎn)化體。本研究表明：當(dāng)農(nóng)桿菌濃度OD600為0.2～0.6時(shí)，抗性愈傷組織數(shù)和抗性愈傷組織率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)OD600為0.2時(shí)，抗性愈傷組織數(shù)和抗性愈傷組織率最低;當(dāng)農(nóng)桿菌濃度OD600為0.4和0.6時(shí)，愈傷組織被農(nóng)桿菌污染的情況少，抗性愈傷組織率分別為60%和75%;當(dāng)OD600為0.6時(shí)，抗性愈傷組織數(shù)和抗性愈傷組織率達(dá)到最高值;當(dāng)OD600為0.8時(shí)，抗性愈傷組織數(shù)和抗性愈傷組織率下降，大量農(nóng)桿菌繁殖。以上4個(gè)濃度處理的抗性愈傷組織數(shù)和抗性愈傷組織率的差異均達(dá)到極顯著水平（表1）。由此可見(jiàn)，農(nóng)桿菌濃度OD600為0.4～0.6時(shí)，愈傷組織狀態(tài)好，獲得的抗性愈傷組織率較高。

2.5 侵染時(shí)間對(duì)愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

侵染時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。侵染時(shí)間過(guò)短，農(nóng)桿菌不能充分吸附，T-DNA不能有效整合，抗性愈傷率低;侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，愈傷水漬軟化，會(huì)被毒害死亡。試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染愈傷時(shí)間為5～10 min時(shí)，愈傷組織質(zhì)量和形態(tài)變化不明顯，抗性愈傷數(shù)和抗性愈傷率的差異均不顯著;當(dāng)農(nóng)桿菌侵染愈傷時(shí)間為15～20 min時(shí)，抗性愈傷數(shù)和抗性愈傷率比5～10 min時(shí)明顯升高，差異極顯著，而且愈傷組織褐化較少;當(dāng)農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為25～30 min時(shí)，抗性愈傷數(shù)和抗性愈傷率呈下降趨勢(shì);30 min時(shí)抗性愈傷數(shù)和抗性愈傷率比15～20 min時(shí)明顯下降，且差異極顯著，共培養(yǎng)基上的愈傷組織出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化干癟現(xiàn)象。因此，本試驗(yàn)確定農(nóng)桿菌的最佳侵染時(shí)間為15～20 min。

2.6 共培養(yǎng)方式對(duì)愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

農(nóng)桿菌菌液在侵染轉(zhuǎn)化愈傷組織時(shí)，農(nóng)桿菌只是黏著在愈傷組織細(xì)胞表面上，并沒(méi)完全滲透到細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中，共培養(yǎng)才是使 T-DNA整合到受體細(xì)胞基因中的主要階段。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，沒(méi)加濾紙的共培養(yǎng)處理，抗性愈傷率僅為44%，究其原因是：農(nóng)桿菌因吸收了培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)而過(guò)度繁殖，從而抑制了抗性愈傷的生長(zhǎng);而加濾紙的共培養(yǎng)處理，抗性愈傷率為76%，顯著高于沒(méi)加濾紙的共培養(yǎng)處理。這是因?yàn)榧訛V紙共培養(yǎng)基的環(huán)境干燥，且減少了農(nóng)桿菌對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的過(guò)度吸收，抑制了農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，有利于抗性愈傷的生長(zhǎng)。說(shuō)明，在共培養(yǎng)基上鋪1～2層的滅菌濾紙，能達(dá)到較好的轉(zhuǎn)化效果。

2.7 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

隨著愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)天數(shù)的增加，愈傷組織污染率也逐漸增加。共培養(yǎng)時(shí)間短，農(nóng)桿菌不易吸附到愈傷組織上，農(nóng)桿菌所攜帶的外源基因也不能完全進(jìn)入到細(xì)胞中，從而降低轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果（表4）表明，4個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間處理之間的抗性愈傷率的差異均達(dá)極顯著水平。共培養(yǎng)1 d時(shí)，獲得抗性愈傷率最低（35.96%）;共培養(yǎng)2 d時(shí)，愈傷底部稍見(jiàn)少量農(nóng)桿菌，其抗性愈傷率顯著提高，為77.26%;共培養(yǎng)3 d時(shí)，愈傷底部聚集了明顯的農(nóng)桿菌，其抗性愈傷率最高，達(dá)82.67%;愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)4 d時(shí)，農(nóng)桿菌大量繁殖生長(zhǎng)，且抗性愈傷率顯著降低，為67.33%?？梢?jiàn)，明恢86的愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的最適宜時(shí)間為2～3 d。

2.8 抗性植株的獲得及檢測(cè)

用多基因遺傳轉(zhuǎn)化載體P5、P8轉(zhuǎn)化明恢86愈傷組織，獲得抗性植株共83株（圖5）。其中：用P5載體轉(zhuǎn)化明恢86，獲得抗性植株60株;用P8載體轉(zhuǎn)化明恢86，獲得抗性植株23株。用CTAB法提取抗性植株的基因組DNA，分別用GUS、RRM、EPSPS、iap、HS等引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：用GUS引物進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖6），P5載體轉(zhuǎn)化明恢86的植株中，有6株抗性植株擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，為陽(yáng)性植株;但是用EPSPS引物、RRM引物、HS引物、iap引物，分別進(jìn)行PCR分析，相應(yīng)的抗性植株并沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，因此需要做進(jìn)一步的確認(rèn)。而用P8載體轉(zhuǎn)化明恢86，用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR分析，未能檢測(cè)出目的條帶，為假陽(yáng)性植株。

3 討論與結(jié)論

將外源基因轉(zhuǎn)入植物基因組是植物分子生物學(xué)和遺傳工程的一項(xiàng)基本技術(shù)，目前大多數(shù)轉(zhuǎn)化技術(shù)只是通過(guò)轉(zhuǎn)化一個(gè)或兩個(gè)外源基因，來(lái)獲得和改善植物的性狀 [13]。但是單獨(dú)轉(zhuǎn)化1～2個(gè)基因，不僅消耗資源，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化周期，對(duì)植物體的改良效果不明顯[14]。為此，為了滿足人們對(duì)植物性狀改良的迫切需要，實(shí)施多基因遺傳轉(zhuǎn)化成為植物基因工程發(fā)展的必然趨勢(shì)。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化中，愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)與轉(zhuǎn)化頻率直接相關(guān)。研究過(guò)程中，首先考慮品種的再生性能，良好的愈傷組織狀態(tài)和具有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力是轉(zhuǎn)化的前提[15-16]。本研究挑選大小為2～3 mm、顏色亮黃、結(jié)構(gòu)密實(shí)的秈稻明恢86幼胚愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，此時(shí)的細(xì)胞處于生命活動(dòng)的旺盛期，接受外源DNA能力強(qiáng)，有助于提高轉(zhuǎn)化效率。

影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素還包括篩選濃度、農(nóng)桿菌活性、農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間以及共培養(yǎng)條件等。不同基因型的植物對(duì)農(nóng)桿菌的侵染敏感度不同，在其他植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化中，所采用的農(nóng)桿菌濃度OD600值為0.5～1.0、侵染時(shí)間20～40 min、共培養(yǎng)時(shí)間2～4 d[17]。陳明利等[18]認(rèn)為，農(nóng)桿菌濃度OD600值小于0.5時(shí)，即使采用長(zhǎng)時(shí)間侵染，轉(zhuǎn)化效率也不高。奚亞軍等[19]在轉(zhuǎn)化小麥的試驗(yàn)中農(nóng)桿菌采用的OD600值為1.5，雷江麗等[20]在做中華結(jié)縷草Zoysiasinica轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌濃度卻采用的OD600值為0.9。本研究在前人建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化秈稻的技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，明確了在農(nóng)桿菌濃度OD600值為0.4～0.6、愈傷組織侵染15～20 min、共培養(yǎng)2～3 d的條件下，可使秈稻明恢86獲得了較高的轉(zhuǎn)化效率。

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中的主要環(huán)節(jié)之一，共培養(yǎng)時(shí)間和共培養(yǎng)方式會(huì)影響農(nóng)桿菌的吸附和T-DNA的轉(zhuǎn)移[21]。與傳統(tǒng)的共培養(yǎng)方式相比，侵染后的愈傷組織在鋪有濾紙的共培養(yǎng)基上，其轉(zhuǎn)化效率高，說(shuō)明干燥的培養(yǎng)環(huán)境更有利于農(nóng)桿菌對(duì)愈傷組織的侵染和轉(zhuǎn)化[22-23]。在遺傳轉(zhuǎn)化篩選的過(guò)程中，培養(yǎng)基篩選是針對(duì)篩選標(biāo)記基因進(jìn)行的，因此只要篩選濃度合適，在篩選培養(yǎng)基上獲得的抗性植株就基本上為轉(zhuǎn)基因植株[24-25]。由于明恢86的愈傷組織對(duì)草甘膦、G418質(zhì)量濃度不是特別敏感，只有提高篩選濃度，愈傷狀態(tài)才會(huì)有顯著的變化。通過(guò)篩選梯度試驗(yàn)，多基因載體P5轉(zhuǎn)化秈稻明恢86選擇的草甘膦質(zhì)量濃度為800 mg·L-1;多基因載體P8轉(zhuǎn)化秈稻明恢86選擇的G418質(zhì)量濃度為150 mg·L-1。

高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的愈傷誘導(dǎo)率、農(nóng)桿菌侵染濃度、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)方式、G418和草甘膦篩選濃度等相關(guān)因素的研究，使秈稻明恢86愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷率和抗性愈傷率得到提高。多基因表達(dá)載體P5、P8，遺傳轉(zhuǎn)化秈稻明恢86，共獲得了83株抗性植株。通過(guò)提取抗性植株的DNA，用GUS、RRM、EPSPS、iap、HS等基因特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：多基因載體P5中的GUS基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入明恢86，且有6株抗性植株為陽(yáng)性植株;多基因載體P8未有基因轉(zhuǎn)入秈稻明恢86，為假陽(yáng)性植株。本研究結(jié)果驗(yàn)證了多基因遺傳轉(zhuǎn)化是可行的，也是極其不穩(wěn)定的。一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化會(huì)出現(xiàn)基因缺失現(xiàn)象，隨著插入?yún)^(qū)域基因越多，插入片段越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化過(guò)程中DNA片段斷裂與缺失的現(xiàn)象就越嚴(yán)重，最終影響轉(zhuǎn)化效果。針對(duì)多基因轉(zhuǎn)化DNA片段斷裂與缺失的現(xiàn)象，今后將嘗試減少基因數(shù)量或進(jìn)行單基因的多次轉(zhuǎn)化等方法，以減少這種現(xiàn)象的發(fā)生。

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