蘇志孟 張習(xí)敏 馬琳 段盛光 陳婷 乙引

摘 要：隨著全球氣候變化加重，干旱強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間逐漸增加，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量。喀斯特為典型的干旱和高鈣生境，植物葉片富集大量的草酸鈣晶體，而該晶體與植物耐旱性之間的關(guān)系并不清楚。該研究以喀斯特適生植物堇菜（Viola verecumda）為材料，土壤進(jìn)行自然干旱，分析堇菜葉片的草酸鈣晶體變化特征與水分之間的關(guān)系。結(jié)果表明：在土壤自然干旱條件下，堇菜主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)束縛水的釋放，維持細(xì)胞內(nèi)水分平衡;而在干旱后期，葉片通過(guò)關(guān)閉氣孔，將部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)槭`水，防止水分流失。此外，草酸鈣晶體的密度與束縛水含量具有極其顯著的強(qiáng)正相關(guān)線性回歸關(guān)系（r=0.825 3，P<0.000 1），表明草酸鈣晶體作為主要的束縛水物質(zhì)。因此，堇菜植物在耐旱過(guò)程中可能協(xié)調(diào)草酸鈣晶體和氣孔的生理行為忍耐干旱脅迫。

關(guān)鍵詞：喀斯特地區(qū)， 抗旱， 葉水勢(shì)， 束縛水， 晶體特征

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）06-0720-09

Abstract：As the global climate changes dramatically， the increasing intensity and duration of drought seriously affects plant growth and crop yield. Karst is a typical arid and high-calcium habitat， and plant leaves in karst areas contain a large amount of calcium oxalate crystals， while the relationship between the crystal and the drought tolerance of plants is not clear.

In this study， we took Viola verecumda grown in karst area as material， and analyzed the relationship between the changing characteristics of calcium oxalate cyrstals and water in its leaves， by subjecting the leaves to natural dry soil.? The results showed that in the early stage of drought stress， V. verecumda maintained the intracellular water balance mainly through the release of intracellular bound water. In the later stage of drought， the leaves mainly prevented water loss by closing the stoma and converting part of the free water into bound water. In addition， the density of calcium oxalate crystals had an significant positive correlation with the bound water content （r=0.825 3， P<0.000 1）， suggesting that calcium oxalate crystals act as the main matter binding water. Therefore， V. verecumda may coordinate the physiological behavior of calcium oxalate crystals and stomatal during drought tolerance.

Key words：karst area， drought resistance， leaf water potential， bound water， crystal characteristics

隨著全球氣候變化和生態(tài)平衡失調(diào)，土地水資源利用短缺，干旱強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間逐漸增加，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)繁殖和作物產(chǎn)量。植物如何耐受干旱脅迫成為當(dāng)今人們面臨的重要問(wèn)題。植物對(duì)干旱的適應(yīng)可分為干旱避免、干旱耐受、干旱逃避和干旱恢復(fù)等方式（Fang & Xiong， 2015; Lawlor， 2013; Luo， 2010; Turner et al.， 2001），涉及的主要機(jī)制分為植物保水、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化脅迫（Fang & Xiong， 2015）。然而，這些機(jī)制主要是植物對(duì)短期水分脅迫的響應(yīng)，在長(zhǎng)期的干旱條件下，植物對(duì)干旱的適應(yīng)性策略仍需進(jìn)一步研究。

草酸鈣是植物中最常見(jiàn)的生物礦物之一，廣泛存在于藻類(lèi)、低等維管束植物、裸子植物和被子植物中，被認(rèn)為是植物生理代謝的惰性產(chǎn)物（Franceschi & Nakata， 2005; Macnish et al.， 2003）。植物體內(nèi)草酸鈣晶體具有多種生理和生態(tài)學(xué)功能，如鈣離子平衡（朱廣龍等， 2014）、妨礙取食對(duì)象的取食（Ward et al.， 1997; 乙引等， 2018）、解毒作用（Choi et al.， 2001）以及光照的聚集和反射（Franceschi & Nakata， 2005）等。近年來(lái)，Tooulakou et al.（2016）研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片被ABA誘導(dǎo)氣孔閉合后，體內(nèi)的草酸鈣晶體進(jìn)行分解形成二氧化碳參與光合作用。草酸鈣晶體通常與水結(jié)合，它在植物體內(nèi)的形成和降解可能影響植物體內(nèi)的水分狀態(tài)。然而，相關(guān)的研究報(bào)道卻極少。

堇菜（Viola verecumda）是堇菜科堇菜屬多年生草本植物，廣泛分布在貴州喀斯特地區(qū)，全草可入藥，具清熱解毒、止咳、散瘀和抗菌的功效，多用于治療肺熱咳嗽、上呼吸道感染、毒蛇咬傷和刀傷出血等，被認(rèn)為是一種天然抗生素（李彥連， 2008; 徐國(guó)兵等， 1995）。在中國(guó)西南貴州喀斯特地區(qū)（王德?tīng)t等， 2005），由于典型的喀斯特地質(zhì)構(gòu)造，土壤函水能力較差，植物經(jīng)常遭受持續(xù)干旱脅迫（李渝等， 2009）。另外，堇菜植物葉片內(nèi)富集大量草酸鈣晶體，是研究喀斯特植物葉片內(nèi)草酸鈣與植物耐旱性關(guān)系的理想材料。因此，本研究以堇菜植物為材料，分析自然持續(xù)干旱脅迫下堇菜葉片水分參數(shù)、氣孔導(dǎo)度和草酸鈣晶體的變化特征以及干旱條件下堇菜葉片水分維持特征，為揭示喀斯特地區(qū)植物耐旱特征提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物生長(zhǎng)與自然干旱

堇菜（Viola verecumda）為喀斯特地區(qū)常見(jiàn)的多年生草本植物，能夠在巖石縫隙中健康生長(zhǎng)（圖1）。本研究從貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)黨武鎮(zhèn)喀斯特山地選取長(zhǎng)勢(shì)相同、大小基本一致的一年生堇菜幼苗，移栽花盆中，每個(gè)花盆中種植4～5株植株。置于 25 ℃，16 h/8 h（晝/夜）光周期，相對(duì)濕度60%的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。在生長(zhǎng)期內(nèi)，定期為植物澆水。待植株生長(zhǎng)3個(gè)月后，選取長(zhǎng)勢(shì)相同、大小基本一致的10盆植株進(jìn)行自然干旱處理。

1.2 自然干旱脅迫

在最后一次給土壤澆水飽和后，停止?jié)菜?。此后，不斷監(jiān)測(cè)土壤含水量，待土壤相對(duì)濕度在40%左右時(shí)，開(kāi)始記為干旱脅迫（0 d），以后每隔2 d測(cè)定一次相關(guān)參數(shù)。

1.3 測(cè)量方法

1.3.1 土壤重量含水量和土壤相對(duì)濕度測(cè)量 在根周?chē)? cm左右的土壤，測(cè)定其鮮重，并置于65 ℃烘箱烘干至恒重，稱(chēng)量土壤干重。土壤重量含水量計(jì)算公式：土壤重量含水量=（土壤鮮重-土壤干重）/土壤干重×100%，土壤相對(duì)濕度（RSWC）=土壤重量含水量/土壤持水量×100%。

1.3.2 葉片含水量和葉片相對(duì)含水量測(cè)量 葉片含水量用稱(chēng)重法，葉片相對(duì)含水量用飽和稱(chēng)重法。取堇菜新鮮離體葉片，稱(chēng)其鮮重，稱(chēng)重后立即浸入去離子水，4 ℃放置8 h后，稱(chēng)飽和質(zhì)量，并置于105 ℃烘干箱中殺青1 h，80 ℃烘干至恒重，稱(chēng)其干重。葉片含水量=（葉片鮮重-葉片干重）/葉片鮮重×100%;葉片相對(duì)含水量=（葉片鮮重-葉片干重）/（葉片飽和鮮重-葉片干重）×100%。

1.3.3 葉水勢(shì)測(cè)量 植物葉片水勢(shì)采用WP4-T露點(diǎn)水勢(shì)儀（WP4-T，Decagon，美國(guó)）測(cè)定。

1.3.4 水分飽和虧缺測(cè)量 水分飽和虧缺（WSD）采用飽和稱(chēng)重法，WSD=（葉片飽和鮮重-葉片鮮重）/（葉片飽和鮮重-葉片干重）×100%。

1.3.5 葉片自由水和束縛水測(cè)量 取適量待測(cè)植物葉片樣品（1 g左右），剪成1～2 mm的小塊后稱(chēng)重（Wy），并放入稱(chēng)量瓶中，加入6 mL 60%的蔗糖溶液：先測(cè)定蔗糖溶液旋光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蔗糖溶液質(zhì)量百分比濃度（C1），稱(chēng)蔗糖溶液質(zhì)量（W），密閉稱(chēng)量瓶，在黑暗環(huán)境中放置6 h，期間不停搖動(dòng)，使葉片和蔗糖溶液充分接觸。再測(cè)定蔗糖溶液的旋光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蔗糖溶液質(zhì)量百分比濃度（C2）。蔗糖溶液旋光度使用阿貝氏折射儀測(cè)定。計(jì)算公式：葉片束縛水含量= 葉片含水量-葉片自由水含量。

葉片自由水含量 = W（C1-C2）C2Wy×100%。

1.3.6 葉片蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度測(cè)量 用Li-6400光合測(cè)定系統(tǒng)（LI-6400XT，LI-COR，美國(guó)）和紅藍(lán)光源葉室（6400-02B）測(cè)定蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）。測(cè)定時(shí)，光合有效輻射設(shè)置為400 μmol·m-2·s-1，流速為500 μmol·s-1，于上午9：00—11：00進(jìn)行，每次隨機(jī)選擇5盆幼苗葉片測(cè)定。

1.3.7 草酸鈣晶體特征 先隨機(jī)取5株新鮮植物葉片，沿主脈剪為0.5 cm長(zhǎng)，0.5 cm寬的小片，用3%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行脫色，直至葉片變?yōu)榘咨糜陲柡退下热┤芤褐蟹胖?4 h。然后于光學(xué)顯微鏡（Nikon 80i， Nikon， Japan）觀察，拍照。采用Digimizer計(jì)算圖片中草酸鈣晶體的密度，隨機(jī)測(cè)定50個(gè)獨(dú)立晶體的直徑。

1.3.8 草酸鈣含量 先取適量的待測(cè)植物的葉片（約200 mg），放入研缽中，加入1 mL的2 mol·L-1 HCl，充分研磨，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中;再用1 mL 的2 mol·L-1 HCl清洗研缽和研棒，將清洗液全部轉(zhuǎn)移至離心管中。于4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。上清液經(jīng)0.45 μm孔徑濾膜過(guò)濾，采用安捷倫1200液相色譜系統(tǒng)（Agilent Technologies Inc. Santa Clara，USA）在215 nm測(cè)定其含量。測(cè)定條件：色譜柱[Carbomix H-NP 10：8%， 7.8 mm × 50 mm， 10 μm（Phenomenex， Torrance，CA， USA）];流動(dòng)相為0.1% H3PO4;流速為0.6 mL·min-1;柱溫為55 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。采用上述相同方法，用草酸（購(gòu)于sigma公司）作為標(biāo)準(zhǔn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算草酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用SigmaPlot 10.0軟件作圖。所有數(shù)據(jù)均為至少3次重復(fù)，值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然干旱下的土壤相對(duì)濕度

由圖2可知，在土壤自然干旱過(guò)程中，干旱時(shí)間18 d，土壤相對(duì)濕度從40%左右降低到約10%。

從第0天到第4天，土壤的相對(duì)濕度下降較為緩慢，下降了1.60%;從第4天開(kāi)始到第14天，土壤的相對(duì)濕度急劇下降，下降了25.46%;從第14天開(kāi)始，土壤的相對(duì)濕度下降又趨于平緩，到第18天，共下降了2.49%。

2.2 自然干旱下堇菜葉片含水量、相對(duì)含水量、水勢(shì)和水分飽和虧損的變化

自然干旱過(guò)程中，堇菜葉片含水量基本維持在80%左右（圖3：A）。同樣，在自然干旱過(guò)程中，堇菜葉片相對(duì)含水量并沒(méi)有出現(xiàn)顯著的降低，一直維持在94%左右 （圖3：B）。WSD不高于10%（圖3：D）。

表明在干旱過(guò)程中，葉片水分流失較少，保水能力較強(qiáng)。另外，在干旱過(guò)程中，堇菜葉水勢(shì)表現(xiàn)為緩慢的下降過(guò)程，在第0天到第10天的干旱期內(nèi)，其葉片水勢(shì)基本維持在-10 ～-15 MPa范圍內(nèi);在第12天，水勢(shì)出現(xiàn)急劇下降（-25.82 MPa）;而后又升高到-20 MPa左右（圖3：C）。結(jié)果表明，在干旱過(guò)程中，葉水勢(shì)維持在較低水平，這有助于植物葉片水分的保持。

2.3 自然干旱下葉片自由水和束縛水含量的變化

植物細(xì)胞內(nèi)存在自由水和束縛水，在植物干旱脅迫下，自由水易于丟失。圖4結(jié)果表明，0～8 d葉片自由水和束縛水基本保持穩(wěn)定，第8天葉片束縛水含量顯著下降，第12天到達(dá)最低（12.35%），之后開(kāi)始增加，第18天葉片束縛水含量急劇增加，值為55.39%，高于干旱前期的含量（圖4：A）;而自由水的變化趨勢(shì)與束縛水卻相反（圖4：A）。整個(gè)干旱過(guò)程中，堇菜葉片自由水與束縛水具有極顯著的負(fù)相關(guān)線性回歸關(guān)系（r=0.955 9，P<0.000 1）（圖4：B）。

2.4 自然干旱下葉片蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度的響應(yīng)

為了分析干旱過(guò)程中，葉片的氣孔生理行為，測(cè)定了堇菜葉片氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率的變化。圖5結(jié)果顯示，在干旱過(guò)程中，蒸騰速率（圖5：A）與氣孔導(dǎo)度（圖5：B）在0～12 d呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)波動(dòng)的變化趨勢(shì)，而在12～18 d兩者總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.5 自然干旱過(guò)程中堇菜葉片中草酸鈣晶體的變化特征

在干旱過(guò)程中，草酸鈣晶體的密度和直徑會(huì)發(fā)生明顯變化。晶體密度上的變化主要體現(xiàn)在第12天時(shí)大量減少（圖6：G，圖7：A）和第18天時(shí)大量增加（圖6：J，圖7：A）。在第0天至第4 天，草酸鈣晶體的密度顯著減少;在第4天至第10 天，晶體的密度緩慢增加;第12天發(fā)生劇減至最低;第12天至第18 天，草酸鈣晶體密度又呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢(shì)，并在第18 天達(dá)到最大值725 個(gè)· mm-2（圖6，圖7：A）。在第0 天，草酸鈣晶體直徑最大，為23.5 μm;干旱第2天，直徑迅速下降為17.72 μm;在第12 天時(shí)，直徑最低為14.33 μm，之后升高到16 μm左右（圖6，圖7：B）。由圖7：C可知，整個(gè)干旱過(guò)程中，堇菜葉片中的總草酸根（包括可溶性草酸和草酸鈣晶體中的草酸根）未見(jiàn)顯著變化。

2.6 自然干旱過(guò)程中堇菜葉片草酸鈣晶體密度與葉片束縛水相關(guān)性分析

為了分析束縛水和草酸鈣晶體密度之間的關(guān)系，對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析，分析結(jié)果表明葉片束縛水含量與草酸鈣晶體的密度具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系（r= 0.825 3，P<0.000 1）。

3 討論

耐旱植物有許多的生理機(jī)制參與調(diào)節(jié)植物的耐旱特征，如滲透調(diào)節(jié)、清除活性氧對(duì)植物的傷害、增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等（Fang & Xiong， 2015; 邵艷軍和山侖， 2006）。此外，植物葉片水分的保持也是植物耐旱的重要方式之一（Fang & Xiong， 2015），植物可通過(guò)誘導(dǎo)葉片氣孔關(guān)閉，減少水分蒸騰從而維持葉片水分（郭自春等， 2015; 張利剛等， 2012）。另外，瓦西里也娃和董任瑞（1956）發(fā)現(xiàn)植物葉片內(nèi)的自由水和束縛水的比值也是評(píng)價(jià)植物抗旱的一個(gè)重要指標(biāo)。為此，本研究通過(guò)研究堇菜在干旱過(guò)程中葉片水分調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)過(guò)程、氣孔導(dǎo)度和草酸鈣晶體的響應(yīng)特征，揭示喀斯特適生植物的耐旱機(jī)制。

喀斯特生境的最顯著特征之一是土壤含水量低，堇菜能在該生境中長(zhǎng)期生存和繁育，這表明該植物具有一定的耐旱能力。植物葉片含水量表示葉片的水分狀況，葉片相對(duì)含水量和水分飽和虧缺分別是反映植物保水能力和缺水狀況的重要指標(biāo)（Fang & Xiong， 2015; 吳麗麗等， 2018）。與耐旱性弱的物種相比，耐旱性強(qiáng)的物種能夠維持較高的含水量和相對(duì)含水量（劉賢德等， 2004; 彭小玲， 2011） ，另外，彭小玲（2011）發(fā)現(xiàn)巖壁上生長(zhǎng)的三種苦苣苔科植物也具有類(lèi)似的保水抗旱機(jī)制。在當(dāng)前研究中，堇菜葉片水分含量、相對(duì)水含量和水分飽和虧缺在干旱過(guò)程中，基本保持不變，表明了植物在干旱過(guò)程中，葉片具有較強(qiáng)的保水能力，從而避免干旱脅迫。

葉片束縛水和自由水的比值是耐旱性的重要指標(biāo)之一（瓦西里也娃和董任瑞， 1956; 陳莉等， 2008）。在兩種硬粒小麥品種Capeiti8（耐旱性）和Creso（干旱敏感）的研究中發(fā)現(xiàn)，耐旱性較強(qiáng)的Capeiti8比Creso富集了更多的束縛水（Rascio et al.， 1992）。這表明葉片束縛水的富集有助于增強(qiáng)植物的耐旱能力。本研究中，堇菜干旱8～12 d，葉片束縛水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?，彌補(bǔ)干旱前期自由水的虧缺，干旱12～18 d，自由水轉(zhuǎn)變成束縛水，有效防止水分流失，增強(qiáng)植物的耐旱性能。

草酸鈣晶體定位于植物葉片細(xì)胞的液泡中，它對(duì)液泡內(nèi)的水分具有較大影響。有研究發(fā)現(xiàn)在荒漠植物沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）、合頭草（Sympegma regelii）和梭梭柴（Haloxylon ammodendron）的葉片含晶細(xì)胞內(nèi)具有大量的草酸鈣晶體，這些含晶細(xì)胞具有較高的滲透勢(shì)和很強(qiáng)的貯水能力，因此認(rèn)為含晶細(xì)胞是荒漠植物的抗旱結(jié)構(gòu)特征之一（劉家瓊， 1982; 朱廣龍和魏學(xué)智， 2016）。本研究中，干旱0～10 d，葉片細(xì)胞內(nèi)草酸鈣晶體的密度變化不明顯，晶體的直徑降低，表明草酸鈣晶體可能發(fā)生少量降解。當(dāng)干旱至第12天時(shí)，草酸鈣晶體直徑和密度降為最低，此時(shí)葉片內(nèi)束縛水含量也急劇下降，表明草酸鈣晶體的密度和直徑與葉片束縛水含量存在一定關(guān)系，葉水勢(shì)出現(xiàn)顯著下降，可能是草酸鈣晶體分解為一些離子，如草酸根和鈣離子，造成細(xì)胞滲透勢(shì)的降低，導(dǎo)致水勢(shì)降低。另外，Tooulakou（2016）研究發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體降解形成二氧化碳和水。本研究通過(guò)測(cè)定草酸根含量表明干旱過(guò)程中草酸根含量未發(fā)生顯著變化，葉片中大量草酸鈣晶體降解，使得晶體內(nèi)的束縛水被釋放，增加了自由水的含量。

氣孔在調(diào)節(jié)葉片水分平衡中具有重要作用，本研究中，干旱脅迫前期（0～12 d），葉片氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率存在波動(dòng)變化，表明該階段氣孔不是限制水分丟失的主要因子。相反，干旱后期（12～18 d），氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率急劇下降，防止水分流失，同時(shí)晶體的密度和直徑增加，表明該階段葉片細(xì)胞內(nèi)的自由水可能與草酸鈣晶體形成束縛水。為更進(jìn)一步分析干旱過(guò)程中束縛水和自由水的相互關(guān)系，對(duì)束縛水和草酸鈣晶體密度進(jìn)行相關(guān)性分析，表明草酸鈣晶體的密度和束縛水之間存在顯著正相關(guān)性（r = 0.825 3，P<0.000 1）。

綜上所述，在干旱脅迫前期，堇菜主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)草酸鈣晶體的降解維持細(xì)胞內(nèi)水分平衡;而在干旱后期，葉片通過(guò)關(guān)閉氣孔，將部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)槭`水，為下一階段的干旱脅迫維持水分平衡。因此，堇菜植物在耐旱過(guò)程中可能協(xié)調(diào)草酸鈣晶體和氣孔的生理行為忍耐干旱脅迫。

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