韓文 陳海珊 袁治豪 秦舒琴 陳慧英

摘 要：李氏禾（Leersia hexandra）是中國境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一種鉻超積累植物，該文對李氏禾內(nèi)生菌及其除鉻性能進行了研究。采用添加Cr（VI） 的牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)方法，從李氏禾根部分離篩選獲得一株具有較強Cr（VI）抗性的內(nèi)生細菌G04，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明該菌株屬于陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。采用搖瓶培養(yǎng)方法，以Cr（VI）去除率、總Cr（鉻）的去除率以及菌體生物量為指標(biāo)，考察了pH、溫度、底物濃度、裝液量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速以及反應(yīng)時間等因素對Cr（VI）去除率、總鉻去除率和菌株生長的影響。結(jié)果表明：在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，菌株E. cloacae G04去除Cr（VI）的較優(yōu)反應(yīng)條件為初始pH5.0、溫度37 ℃、Cr（VI）濃度為100 mg·L-1、裝液量80 mL（250 mL三角瓶）、接種量15%、搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1、反應(yīng)時間48 h。在此條件下，菌株E. cloacae G04對Cr（VI）和總鉻的去除率分別為84%和8%。根據(jù)Cr（VI）去除率和總鉻去除率的結(jié)果推測該菌株去除Cr（VI）的機制可能是以還原為主、吸附為輔。這表明李氏禾內(nèi)生細菌E. cloacae G04菌株具有較好的應(yīng)用潛力，既有可能直接用于土壤、水環(huán)境鉻污染的修復(fù)，也有可能作為促植物修復(fù)鉻污染的后備菌株，另外可為深入研究李氏禾的鉻積累作用機制提供參考。

關(guān)鍵詞：李氏禾， 內(nèi)生細菌， 陰溝腸桿菌， Cr（VI）， 還原

中圖分類號：Q946， X172

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）06-0729-08

Abstract：Leersia hexandra? is a chromium hyper-accumulative plant which was firstly found in China. The endophytic bacteria of L. hexandra? and their removal capacity for Cr（VI） were studied. A Cr（VI）-resistant endophytic bacterium G04 was isolated from the roots of L. hexandra  by solid plate culture method using the media of beef extract peptone containing Cr（VI）. Biological identification results showed the strain belonged to Enterobacter cloacae. Effects of culture conditions， such as initial pH， temperature， Cr（VI） concentration， liquid volume， inoculation amount， shaking speed and culture time， on the removal rate of Cr（VI）， removal rate of total Cr and the growth of the strain were studied in detail by shaking flask culture. The results showed that the optimal conditions for the removal of Cr（VI） by E. cloacae G04 were? initial pH of 5.0， culture temperature of 37 ℃， substrate concentration of 100 mg·L-1， liquid volume of 80 mL in 250 mL conical flask， inoculum size of 15%， shaking speed of 100 r·min-1 and culture time of 48 h. Under these conditions， the removal rate of Cr（VI） and total chromium were about 84% and 8%， respectively. The results of this study indicate that the endophytic bacteria Enterobacter cloacae G04 has better application potential for removing chromium. It may be used directly for remediation of soil and water environment contaminated of chromium， and also may be used as alternative strain for promoting plant remediation of chromium pollution. Furthermore， the result has an important refe-rence value for illuminating the mechanism of chromium hyper-accumulation of L. hexandra.

Key words：Leersia hexandra， endophytic bacteria， Enterobacter cloacae， hexavalent chromium [（Cr（VI）]， reduction

隨著現(xiàn)代化技術(shù)的發(fā)展，重金屬鉻在制藥、電鍍等多領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。但與此同時，環(huán)境中的鉻及其化合物的污染問題也越來越嚴重。長期接觸鉻及鉻化合物容易對胃腸道系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肝臟和腎臟產(chǎn)生影響甚至誘發(fā)呼吸系統(tǒng)癌癥（Costa，1997）。各種鉻形態(tài)中，主要以鉻酸根和重鉻酸根形式存在的Cr（VI）被認為是毒性最強的（Shanker et al.，2005;王新建和劉健，2010）。國際上對鉻污染的水體、土壤都提倡采用生物修復(fù)法，即借助微生物或植物的絮凝、吸收累積、富集等作用去除重金屬離子（Chibuike & Obiora，2014;Malik et al.，2010）。從鉻重金屬污染的環(huán)境中分離的白色桿菌屬（Leucobacter sp.）（Ge et al.，2013）、假單胞菌屬（Pseudomonad）（Zhang et al.，2016）、鏈霉菌屬（Streptomyces griseus）（Chen et al.，2014;Poopal & Laxman，2008）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）（Alsalamah，2011;Dhal et al.，2010）和棲熱菌屬（Thermusscotoductus）（Opperman & Van，2007）都具有較好的Cr（VI）去除能力。

超富集植物具有生物量大、對重金屬吸附量是常規(guī)植物的10～500倍、可在重金屬污染土壤中生長良好等優(yōu)勢（石潤等，2015），在環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用日益廣泛（Brooks et al.，1998）。與此同時，超富集植物內(nèi)生菌的研究也開始受到研究者的重視，如As（砷）超富集植物蜈蚣草（董睿智，2012）、Zn（鋅）超富集植物東南景天（龍新憲等，2013）、Cd（鎘）超累積植物龍葵（曹喆等，2009）、Mn（錳）超積累植物商陸（盧文顯，2015）等均有研究報道。李氏禾（Leersia hexandra）是張學(xué)洪等（2007）在廣西桂林發(fā)現(xiàn)的鉻超積累植物，也是第一種在中國境內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的鉻超積累植物，研究表明其對Cr（Ⅲ）和Cr（VI）都有較強的富集能力（胡澄，2008;陳俊等，2008;盧媛媛等，2013）。但目前利用李氏禾內(nèi)生細菌對重金屬Cr（VI）進行還原的研究尚未見報道。本研究對鉻超富集植物李氏禾中的內(nèi)生細菌進行分離、篩選、鑒定及除Cr（VI）特性進行研究，為李氏禾內(nèi)生菌在鉻污染修復(fù)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 Cr（鉻）超富集植物李氏禾，采自桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，其余為蒸餾水，pH為7.0。

液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，其余為蒸餾水，pH為7.0。

含Cr（VI）培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨固/液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入相應(yīng)質(zhì)量的重鉻酸鉀配制而成。

1.2 Cr（VI）抗性內(nèi)生細菌的分離、篩選取健康的李氏禾根根部組織，用水沖洗干凈后，無菌條件下用70%的酒精浸泡40 s，然后用2.5%次氯酸鈉浸泡2 min，最后用無菌水沖洗6次，去除附著在材料表面的消毒劑。無菌條件下用最后一遍沖洗的無菌水涂布于固體平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)后無微生物長出，表明表面消毒徹底。無菌條件下取適量經(jīng)表面消毒的根部組織，加1 mL 0.9%的氯化鈉溶液充分研磨，取1 mL研磨液接種于100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶），37 ℃，120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6進行稀釋，分別取20 μL用平板涂布器涂布在含Cr（VI）濃度分別為100～1 000 mg·L-1的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，根據(jù)菌落的生長情況，挑選長勢較好、耐鉻性能強的菌落，接入含鉻平板中，采用劃線法進行多次的分離純化，獲得了Cr（VI）抗性內(nèi)生菌純培養(yǎng)物，并將菌株接種于試管斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，4 ℃冰箱保存。

1.3 Cr（VI）抗性細菌的鑒定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）有限公司）對Cr（VI）抗性內(nèi)生細菌G04基因組進行提取。PCR擴增反應(yīng)體系：2×Taq DNA聚合2 μL，酶25 μL，模板2 μL，引物1492R和27F各2 μL，ddH2O 19 μL，混勻后置于PCR擴增儀。其程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃后延伸5 min，30個循環(huán)。用1%的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE為電泳緩沖液、80 V電壓進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。將G04菌株DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程（上海）有限公司進行檢測。檢測的結(jié)果登錄美國的NCBI網(wǎng)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行DNA的Blast比對，確定菌株歸屬。

1.4 內(nèi)生細菌G04去除Cr（VI）實驗

試管斜面保存的菌株G04經(jīng)牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板活化，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取2環(huán)接種于含100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h后作為種子液。以不接種的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基同法處理，作為后續(xù)除Cr（VI）試驗中接種培養(yǎng)的空白對照。

將種子液按10%接種量接種于含Cr（VI）濃度為100 mg·L-1、pH為7（用2 mol·L-1的氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)）的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（裝液量100 mL/250 mL三角瓶）中，八層紗布封口，置于37 ℃的恒溫水平搖床上120 r·min-1振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)適當(dāng)時間后，無菌條件下取樣適量培養(yǎng)液，10 000 r·min-1離心10 min，去除菌體和其他懸浮雜質(zhì)。沉淀用蒸餾水溶液混勻，測定OD600下吸光度值，上清液用于測定Cr（Ⅵ）的濃度和總Cr（鉻）的濃度。上述步驟中，以不接種微生物的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基代替種子液同法操作，作為空白對照。

1.5 Cr（VI）和總Cr（鉻）的測定

Cr（VI）標(biāo)準曲線的繪制：分別取5 mg·L-1的Cr（VI）標(biāo)準溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL刻度比色管中，用蒸餾水至刻度后，分別加入（1+1）的硫酸和磷酸各0.1 mL后，加入0.4 mL二苯碳酰二肼溶液，搖勻。待充分反應(yīng)5～10 min后，測定樣品在540 nm波長處的吸光度值。以Cr（VI）濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)540 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制Cr（VI）標(biāo)準曲線。

Cr（VI）的測定：取1.0 mL待測含Cr（VI）試樣，加水稀釋至10 mL。取1 mL含鉻稀釋液，加入到10 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至刻度，加入（1+1）硫酸0.1 mL 和（1+1）磷酸0.1 mL，搖勻。加入0.4 mL二苯碳酰二肼溶液，搖勻。5～10 min后，于540 nm波長處比色測定。在標(biāo)準曲線上查得Cr（VI）濃度，求得質(zhì)量后按式（1）計算Cr（VI）去除率。

Cr（VI）去除率=Cr（VI）初始質(zhì)量-Cr（VI）殘余質(zhì)量Cr（VI）初始質(zhì)量×100%（1）

總Cr（鉻）的測定：取1.0 mL待測含Cr（VI）試樣，加水稀釋至10 mL。取1 mL含鉻稀釋液，和（1+1）磷酸0.1 mL，搖勻。加入4%高錳酸鉀溶液滴，如紫紅色消退，則繼續(xù)滴加高錳酸鉀溶液至保持紫紅色。加熱煮沸至溶液約剩4 mL。冷卻后，加入0.2 mL 20%的尿素溶液，搖勻。用滴管加2%亞硝酸鈉溶液，每加一滴充分搖勻，至紫紅色剛好消失。稍停片刻，待溶液內(nèi)氣泡逸盡，轉(zhuǎn)移10 mL比色管中，稀釋至標(biāo)線，按Cr（VI）的測定方法比色測定。按式（2）計算總鉻去除率。

總鉻去除率=理論總鉻質(zhì)量-殘余總鉻質(zhì)量理論總鉻質(zhì)量×100%（2）

Cr（VI）和總鉻去除率最終結(jié)果均扣除空白對照，以排除培養(yǎng)基成分對反應(yīng)的影響。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Micrsoft Office Excel 2007軟件對結(jié)果進行差異顯著性分析（t檢驗，置信水平0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

按1.2方法對李氏禾Cr（VI）抗性內(nèi)生細菌進行分離純化，結(jié)果從李氏禾根部獲得一株具有較強Cr（VI）抗性的菌株G04，按1.3方法對該菌株進行DNA序列分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。結(jié)果表明李氏禾Cr（VI）抗性內(nèi)生細菌G04與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae strain R2-5A）（HQ154552.1）、（E. cloacae strain R6-354）（JQ659813.1）等菌株的序列同源性達99%，歸屬于E. cloacae，將其命名為E. cloacae G04。陰溝腸桿菌（E. cloacae）是一類應(yīng)用較廣泛的微生物，具有植物促生作用（徐幼平等，2001）、固氮作用（楊海蓮等，2001）、降解柴油（Ramasamy et al.，2017）和農(nóng)藥（林抗美等，2008）、吸附/固定Cd2+（Xu et al.，2017）等作用。陰溝腸桿菌（E. cloacae）除Cr（VI）

2.2 Enterobacter cloacae G04去除Cr（VI）的特性

2.2.1 初始pH的影響 按1.4方法，固定其他條件不變，改變液體培養(yǎng)基的pH，考察pH對G04菌株除Cr（VI）的影響，結(jié)果如圖2所示。

2.2.2 溫度的影響 按1.4方法，固定其他條件不變，考察溫度對G04菌株除Cr（VI）的影響，結(jié)果如圖3所示。

2.2.3 Cr（VI）初始濃度的影響 按1.4方法，固定其他條件不變，改變Cr（VI）底物濃度，考察底物濃度對G04菌株除Cr（VI）的影響，結(jié)果如圖4所示。

2.2.4 裝液量的影響 按1.4方法，固定其他條件不變，考察裝液量對G04菌株除Cr（VI）的影響，結(jié)果如圖5所示。

2.2.5 接種量的影響 按1.4方法，固定其他條件不變，考察接種量對G04菌株除Cr（VI）的影響，結(jié)果如圖6所示。圖6結(jié)果表明，當(dāng)接種量小于15%時，菌株的生長情況和除Cr（VI）呈正相關(guān)性，Cr（VI）的去除率隨著接種量的增加而增大，即生長較好的菌液具有更高的Cr（VI）去除能力。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，接種量對Cr（VI）去除率和菌株生長的影響顯著（P<0.05），而對總鉻去除率不顯著。當(dāng)接種量為15%時，Cr（VI）去除效果最佳，故選擇Enterobacter cloacae G04接種量為15%。

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速的影響 按1.4方法，固定其他條件不變，考察接種量對G04菌株除Cr（VI）的影響，結(jié)果如圖7所示。

2.2.7 反應(yīng)時間的影響 按1.4方法，固定其他條件不變，考察反應(yīng)時間對G04菌株除Cr（VI）的影響，結(jié)果如圖8所示。

3 討論與結(jié)論

本研究從鉻超積累植物李氏禾根部組織中分離獲得一株Cr（VI）抗性內(nèi)生細菌E. cloacae G04，采用單因素試驗研究pH、溫度、底物濃度、裝液量、接種量、搖床培養(yǎng)以及反應(yīng)時間等因素對該菌株去除Cr（VI）性能的影響。在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，較優(yōu)反應(yīng)條件是pH為5.0、溫度為37 ℃、Cr（VI）底物濃度為100 mg·L-1、裝液量為80 mL/250 mL、接種量為15%、搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1、反應(yīng)時間48 h。此條件下，菌株E. cloacae G04對Cr（VI）的去除率約為84%，總鉻去除率為8%。該菌株對Cr（VI）的去除率遠高于總Cr（鉻）去除率，表明該菌株主要是通過改變Cr（VI）價態(tài)的形式實現(xiàn)去除Cr（VI）的作用。關(guān)于陰溝腸桿菌（E. cloacae）的除Cr（VI）作用， Rahman et al.（2016）、張劍（2011）和Wang et al.（1989）等的研究表明其作用機制主要為還原Cr（VI）。本研究的結(jié)果與上述報道一致，推測李氏禾內(nèi)生細菌E. cloacae G04對Cr（VI）去除機制可能也是以還原為主，但具體的作用機制還有待更加深入地研究。與已有的除Cr（VI）微生物相比較，如耐酸脫硫弧菌Desulfovibrio SRB7（馬小珍等，2009）、炭疽芽孢桿菌（徐衛(wèi)華，2007）等，李氏禾內(nèi)生細菌E. cloacae G04在耐Cr（VI）濃度、除Cr（VI）效率方面具有一定的優(yōu)勢。

本研究結(jié)果表明，從李氏禾中分離的Cr（VI）抗性內(nèi)生細菌E. cloacae G04菌株具有較強的除Cr（VI）性能，在土壤、水環(huán)境鉻污染的修復(fù)中具有較好的應(yīng)用潛力，也有可能作為促進植物修復(fù)鉻污染的備選菌株，另外也可為深入研究李氏禾的鉻積累作用機制提供一定參考。今后尚需深入研究該菌株的除Cr（VI）作用機制、除Cr（VI）動力學(xué)、實際應(yīng)用條件等，以便在今后的應(yīng)用中發(fā)揮最大效益。

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