任朋朋　姜于蘭

摘 要：采集貴州凱里雷山森林公園的土壤，分離得到一株絲狀真菌，結(jié)合形態(tài)特征及分子系統(tǒng)學(xué)分析基于 ITS、TEF1-a和LSU三個基因片段，在系統(tǒng)進化樹上，菌株HGUP-R300 與Exophiala abietophila聚集在一起，并且形成100%的支持率，將該種鑒定為Exophiala abietophila。

關(guān)鍵詞：外瓶霉;形態(tài)學(xué);分子系統(tǒng)學(xué);新記錄;中國

中圖分類號：S432.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）05-0084-05 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.05.015

A New Recorded Species of Exophiala in China

REN Peng-peng1 JIANG Yu Lan*

（Department of Plant Pathology， Agricultural College， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：：A newly recorded strain of the genus Exophiala was isolated from the soil of the forest of Leishan in Kaili， Guizhou. This species was identified by combining morphological characters and phylogenetic analysis based on sequences of Internal Transcribed Spacer （ITS）， Ribosomal Large Subunit （LSU）， and translation elongation factor 1-alpha（TEF1-α）gene. The phylogenetic analysis revealed that the strain HGUP-R300 was clustered with Exophiala abietophila. The strain was strongly supported to be identified as E. abietophila. The holotype and ex-type cultures are preserved in the Plant Pathology Laboratory of Guizhou University（ HGUP）.

Key words： Exophiala;Morphology; Molecular phylogeny; New recorder; China

外瓶霉屬Exophiala J.W.Carmich由J.W.Carmich于1966年建立，屬于子囊菌門盤菌亞門刺盾炱綱刺盾炱目小皰毛殼科，Carmich 在1966年從鮭魚魚頭上分離得到Exophiala.salminis，并且以該種為模式種建立外瓶霉屬Exophiala[1]。該屬主要的形態(tài)特征是菌落疏展，生長緩慢，菌絲體埋生或表生，無子座，隔膜與附屬絲缺乏;分生孢子梗直立或彎曲，不分枝或不規(guī)則分枝，光滑，淺橄欖色到棕色;產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗式。

該屬真菌分布廣泛，通常從土壤、木材以及一些植物材料上分離得到。

外瓶霉屬Exophiala 屬于黑酵母真菌，該屬的種大都引起人類疾病[2]，例如，引起人的皮膚病，其中，E.spinifera的致病性最強[3]，基于ITS、TEF1-α、BT2、ACT1四個基因構(gòu)建多基因和單基因進化樹，結(jié)果顯示：ITS等基因片段能用于外瓶霉屬屬內(nèi)部分真菌進行初步鑒定[4]。近年來，分子技術(shù)的普及使得真菌分類有了新的研究方法，越來越多的研究者采用分子技術(shù)來解決形態(tài)相似屬間、種間及種下單位等真菌類群間的分類學(xué)問題[5]。

在外瓶霉屬的分類鑒定過程中，許多學(xué)者對于外瓶霉屬種類數(shù)量，仍然存在分歧，目前Mycobank Database（http：//www.mycobank.org）記錄58種（截止2018年12月），Index Fungal Database（http：//www.speciesfungorum.org）記錄56種（截止2019年4月）。2018年4月，筆者收集貴州省雷公山國家自然保護區(qū)的土壤標(biāo)本，從暗色絲孢菌中分離獲得一株未知真菌。查閱資料并結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)學(xué)的分析結(jié)果，確認(rèn)該菌為中國真菌新記錄種。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本和菌株

土壤樣品于2018年4月采于貴州省雷公山自然保護區(qū)（E108°09′～108°22′，N26°15′～26°22′），樣品編號為LGS-R147，放入塑料袋，土壤平板稀釋法[6]進行真菌分離。

1.2 獲得純菌種

使用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基PDA純化菌株，研究標(biāo)本保存在貴州大學(xué)植物病理學(xué)實驗室（HGUP），菌株編號為HGUP-R300。

1.3 菌株DNA提取、PCR擴增與測序

菌株DNA的提取采用試劑盒 Fungal gDNA Kit GD2416（Biomiga 公司生產(chǎn)），并按照說明方法進行提取。選擇相應(yīng)的引物對菌株DNA進行ITS（ITS4/ITS5）、LSU（LROR/LR5）與TEF1-α（EF1-728F/EF-986R）三個片段進行擴增測序。本研究使用25 μL PCR反應(yīng)體系，其中正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，Taq聚合酶12.5 μL，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，合格的樣品，送到上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。所用基因片段與引物如表1所示。

1.4 分子系統(tǒng)學(xué)

用Bioedit軟件結(jié)合序列峰圖檢測從測序公司獲得的序列是否準(zhǔn)確，若顯示雙峰或雜峰，則序列不可信，需要重新測序。將峰值整齊的序列上傳到 NCBI（National Center for Biotechnology Information）的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）進行比對，確定其屬級分類地位。將測序結(jié)果正常的序列上傳GenBank 并獲取基因登錄號。通過參閱相關(guān)文獻，從GenBank中下載參比序列（權(quán)威期刊最新發(fā)表外瓶霉屬的基因序列），如表2所示。將用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的序列經(jīng)Bioedit進行比對及手工校正后[11]，保存為Fasta格式，然后在MEGA7.0.26里面按ITS+TEF1-α+LSU的順序進行基因拼接，輸出為NEXUS/PAUP格式，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件PAUP*4.0b10（Swofford2002）運行該文件，所有堿基位點進行隨機處理，缺失堿基視為數(shù)據(jù)缺失;分析主要參數(shù)設(shè)置為：最大樹值設(shè)置為5000，Bootstrap自舉檢測值為1000，執(zhí)行最大簡約（maximum parsimony，MP）法的分析運算，得到系統(tǒng)進化樹，如圖1所示。

1.5 形態(tài)學(xué)記述

分離純化菌株，待其在燕麥培養(yǎng)基（配方：20 g燕麥片，5 g瓊脂糖，1000 mL自來水，混合煮沸，過濾，滅菌備用）上產(chǎn)孢后（25℃，20～25 d），挑取分生孢子和分生孢子梗做成潔凈的玻片于光學(xué)顯微鏡下（Olympus BX53，Japan）觀察拍照，記述菌株的形態(tài)顯微結(jié)構(gòu)特征，并做出合格圖版。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

該進化樹組合了38個分類單元的ITS + TEF1-α+LSU共87條序列所構(gòu)建，共有1819位點，其中，672個一致性位點，663個可變信息位點，484個信息位點。樹長（TL）為2543，一致性指數(shù)（CI）為0.6461，保存力指數(shù)（RI）為0.6920，相似性指數(shù)為（0.3539）。從圖1可知，菌株HGUP-R300（進化樹加粗部分）以100%的進化支持率與菌株Exophiala abietophila BS 145038 聚在一起，自舉支持率很高，與其呈現(xiàn)出同等的分類地位。

2.2 形態(tài)學(xué)描述

Exophiala abietophila Crous & R.K. Schumach.

在燕麥培養(yǎng)基上，菌絲稀疏，淺棕色，菌落生長緩慢，25℃光照培養(yǎng)25～27 d直徑為30～40 mm，菌落棕土色一般疏展，無子座，附屬絲與剛毛缺乏;菌絲光滑有隔膜，表生或埋生，半透明到橄欖至棕色。分生孢子梗（11～22 μm×2～3 μm），半直立或彎曲，不分枝或不規(guī)則分枝，不分枝時在梗頂端直接進行產(chǎn)孢。產(chǎn)孢梗內(nèi)壁芽生單瓶梗式產(chǎn)孢，產(chǎn)孢位點淺棕色，安瓿形或甕形。分生孢子（1.8～2.4 μm×1.6～2.0 μm），橢球形或球形，平滑，無隔膜，無色透明或半透明，尖端鈍圓，內(nèi)具1～2個油滴[12]。

3 結(jié)論與討論

外瓶霉屬真菌中的大部分種類是一類能使人、動物與植物患病的病原菌。如E.dermatitidis導(dǎo)致人的皮炎[13]，E.salmonis能夠引起鮭魚腎臟的腫脹[14]。在鑒定過程中，我們首先選取了ITS（該基因片段是真菌研究中最常用的序列標(biāo)記），對菌株的屬級分類地位進行確認(rèn)，達(dá)到與形態(tài)學(xué)相同的鑒定結(jié)果，然后選取另外兩個片段（TEF1-α與LSU）時發(fā)現(xiàn)，3個片段在軟件Mega7里的加合順序會影響進化樹的自舉支持率，在查閱文獻[15]的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)本研究的加合方式更能確定菌株HGUP-R300的分類地位。

從前人研究結(jié)果看[16]，外瓶霉屬分類工作一直不穩(wěn)定。該屬建立至今，屬下種的形態(tài)學(xué)特征變化較大，產(chǎn)孢較慢，不易鑒定，單靠形態(tài)學(xué)難以準(zhǔn)確鑒定到種級水平。本研究結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)，認(rèn)為菌株HGUP-R300與Crous P W等人[10]發(fā)表的E.abietophila菌株為同一個種。

真菌的準(zhǔn)確鑒定在真菌物種多樣性考察過程中尤為重要[17]，在一些真菌無法產(chǎn)孢或產(chǎn)孢較慢時，可以先對其進行分子系統(tǒng)學(xué)研究，輔以形態(tài)學(xué)研究補充。

菌株HGUP-R300的屬級特征滿足外瓶霉屬的屬級特征，盡管環(huán)痕條帶有時不明顯，但它仍是外瓶霉屬真菌的主要鑒別特征。

參 考 文 獻：

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