呂杰 韓嬋琳 何文 蔡柳洪

【關(guān)鍵詞】 卵巢早衰;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞;減數(shù)分裂;卵子

Study of differentiation of premature ovarian failure patients-specific induced pluripotent stem cells into haploid cells Lyu Jie， Han Chanlin， He Wen， Cai Liuhong. Department of Reproductive Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Cai Liuhong， E-mail： cailh@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】 Objective To explore the possibility of premature ovarian failure patients specific-induced pluripotent stem cells （POF-iPSCs） differentiating into haploid cells. ?Methods The monocytes in the peripheral blood of POF patients were nuclear stained and reprogrammed into iPSCs to establish POF-iPSCs， and subsequently cultured with activin A and glycogen synthase kinase-3 （GSK-3） inhibitor （CHIR-99021） for 2 d， supplemented with bone morphogenetic protein 4 （BMP 4） and epidermal growth factor （EGF） for 5 d， and retinoic acid （RA） for 7 d. The baseline （D0）， 7 d-culture （D7） and 14 d-culture （D14） and control groups were established. qPCR and immunofluorescent staining were performed to detect the expression levels of mRNA and protein of primordial germ cells and the meiosis-related genes. FISH was adopted to detect the intracellular X chromosome segregation. Flow cytometry was conducted used to determine the proportion of haploid cells. ?Results During the induction process of POF-iPSCs， the fusiform fiber-like cells were observed in the D0 group， the cell body was enlarged with thin cytoplasm and multiple antennae in the D7 group， and the cell nucleus and nucleolus became evident in the D14 group. The relative expression level of NANOG mRNA was down-regulated， whereas that of BLIMP1 was gradually up-regulated along the differentiation. STELLA， OCT4， DDX4， γH2AX and MLH1 mRNA levels were the highest in the D7 group， and DAZL， SYCP3 and PRDM9 mRNA levels were gradually up-regulated from the D7 to D14 groups （all P < 0.01）. DAZL， PRDM9 and SCP3 proteins were not expressed in the D0 group. DAZL and PRDM9 proteins were positively expressed in the D7 group. DAZL， PRDM9 and SCP3 proteins were expressed in the D14 group. FISH demonstrated that no X chromosome segregation was detected in the control group. X chromosome segregation was observed in partial cell nucleus in the D14 group， prompting the possibility of haploid cells. The chromosomes during meiosis were observed in all groups. In the D14 group， the proportion of haploid cells was significantly higher compared with those in the remaining three groups （all P < 0.01）. Conclusion POF-iPSCs can differentiate into primordial germ cells after in vitro culture. Some cells can complete meiosis and differentiate into haploid cells.

【Key words】 Premature ovarian failure;Induced pluripotent stem cells;Meiosis;Oocyte

卵巢早衰在生育年齡的婦女中發(fā)病率為1% ～ 3%，缺乏發(fā)育成熟的卵子是卵巢早衰患者解決生育需求的最大困境[1]。卵巢異體移植已經(jīng)有成功的案例報(bào)道，但移植物的稀缺及倫理問題無法解決[2]。來源于患者自身的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）體外誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲得生殖細(xì)胞是治療卵巢早衰患者的新思路，可以避免免疫排斥反應(yīng)及異體干細(xì)胞移植的倫理困擾。近年已有報(bào)道將小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）及iPSC分化為類原始生殖細(xì)胞（PGCLC）及有功能的卵子[3-4]。然而，從人類ESC或iPSC體外制備人類卵子的研究仍未能取得成功，且高效率的PGCLC培養(yǎng)方法仍是研究的重點(diǎn)[5]。2018年Yamashiro等[6]將人類iPSC與小鼠卵巢組織進(jìn)行體外共培養(yǎng)后分化成為類卵原細(xì)胞，但未進(jìn)行減數(shù)分裂。本研究組于2015年已成功建立了卵巢早衰患者來源的iPSC（POF-iPSC）株[7]。本研究嘗試使用POF-iPSC進(jìn)行誘導(dǎo)分化，探討其分化為減數(shù)分裂期細(xì)胞的潛能，為卵巢早衰患者的治療提供新的思路。

材料與方法

一、細(xì)胞來源

POF-iPSC為課題組之前以卵巢早衰患者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)染自行建系[7]。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞與研究方案均已經(jīng)通過倫理審查。

二、主要試劑

視黃酸、氟維司群及糖原合酶激酶-3（GSK-3）抑制劑（CHIR-99021）購自美國MCE公司。激活劑A、大腸埃希菌表達(dá)的骨形態(tài)生成蛋白4（BMP 4）、抗壞血酸、表皮生長因子（EGF）購自美國Pepro Tech公司。由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成引物的序列信息見表1。設(shè)計(jì)引物相關(guān)的基因包括：NANOG、POU轉(zhuǎn)錄因子家族OCT4、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子BLIMP1、發(fā)育多能性基因STELLA、生殖細(xì)胞及減數(shù)分裂相關(guān)基因DAZL、生殖細(xì)胞特異性蛋白DDX4、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子PRDM9、組蛋白家族成員γh2AX、聯(lián)會(huì)復(fù)合物蛋白SYCP3及錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1和輔肌動(dòng)蛋白基因ACTIN。Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自日本Takara公司。X染色體著絲粒探針購自美國Abbott公司?？笵AZL抗體（ab34139）、抗SYCP3抗體（ab15093）和抗PRDM9抗體（ab101013）購自美國Abcam公司。驢抗兔IgG二抗（594 nm）購自美國Invitrogen公司。DAPI購自美國CST公司。細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒購自中國飛凈公司。

三、方 法

1. PGCLC的誘導(dǎo)分化

制備培養(yǎng)液A、B、C、D，成分見表2。加入培養(yǎng)液A原代培養(yǎng)POF-iPSC為D0細(xì)胞（D0組），每日換液。加入培養(yǎng)液B培養(yǎng)2 d，再更換為培養(yǎng)液C培養(yǎng)5 d，共7 d，為D7細(xì)胞（D7組），每日換液。再加入培養(yǎng)液D培養(yǎng)7 d，為D14細(xì)胞（D14組），每日換液。對(duì)照組為D0細(xì)胞僅加入培養(yǎng)液A培養(yǎng)14 d，每日換液。

2. 不同誘導(dǎo)階段細(xì)胞相關(guān)基因mRNA水平變化

采用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測，取D0組、D7組、D14組細(xì)胞，提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA后，將模板DNA加入PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，95℃15 s、60 ℃60 s，循環(huán)40次，72 ℃延伸30 s。以β-actin為內(nèi)參照，使用2-ΔΔct法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次測定，結(jié)果取平均值。

3. 不同誘導(dǎo)階段的細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物觀察

采用免疫熒光染色法，取D0組、D7組、D14組細(xì)胞，抗DAZL抗體、抗SYCP3抗體和抗PRDM9抗體為一抗，二抗避光孵育40 min，DAPI染核。使用熒光顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

4. 不同誘導(dǎo)階段的細(xì)胞X染色體觀察

采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測，取D0組、D7組、D14組及對(duì)照組細(xì)胞，固定于玻片中，使用X染色體著絲粒探針雜交，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡觀察雜交信號(hào)MERGE。

5. 不同誘導(dǎo)階段細(xì)胞的胞內(nèi)染色體含量變化

采用流式細(xì)胞儀檢測，取D0組、D7組、D14組及對(duì)照組細(xì)胞，固定、磷酸清洗后，添加碘化丙碇和核糖核酸酶混合液以染色。使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm檢測紅色熒光及散射光。采用ModFIT LT 2.0（Verity Software House Company，美國）軟件分析細(xì)胞DNA含量及光散射，分析位于二倍體細(xì)胞（即G0/G1期細(xì)胞）DNA含量的一半處的細(xì)胞的含量，即單倍體細(xì)胞的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞誘導(dǎo)過程中的形態(tài)變化

POF-iPSC在誘導(dǎo)過程中，D0組細(xì)胞形態(tài)為長梭形纖維樣，D7組細(xì)胞體積變大，但胞質(zhì)稀薄，具有多個(gè)觸角，D14組細(xì)胞核及核仁變得明顯，見圖1。

二、不同誘導(dǎo)階段生殖細(xì)胞相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

在mRNA相對(duì)表達(dá)水平上，NANOG隨分化而下降，BLIMP1逐步上升，STELLA、OCT4、DDX4、γH2AX、MLH1于D7組最高，DAZL、SYCP3、PRDM9于D7組及D14組逐步升高（P均< 0.01），見圖2。

三、不同誘導(dǎo)階段生殖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)比較

D0組細(xì)胞中DAZL、PRDM9、SCP3蛋白均呈陰性表達(dá);D7組細(xì)胞中DAZL及PRDM9蛋白呈陽性表達(dá);D14組細(xì)胞中DAZL、PRDM9、SCP3蛋白均呈陽性表達(dá)，見圖3。

四、不同誘導(dǎo)階段細(xì)胞的FISH檢測結(jié)果比較

針對(duì)X染色體著絲粒的FISH檢測顯示，對(duì)照組細(xì)胞中均未見單個(gè)X染色體顯色的細(xì)胞;D14組的部分細(xì)胞核中有單個(gè)X染色體顯色，提示其單倍體的可能。D0組、D7組、D14組及對(duì)照組細(xì)胞中均可見發(fā)生分裂狀態(tài)的染色體，見圖4。

五、不同誘導(dǎo)階段的單倍體細(xì)胞比例比較

討 論

體外誘導(dǎo)生成的卵巢早衰患者自身來源單倍體生殖細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究應(yīng)用POF-iPSC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)相關(guān)標(biāo)志物及DNA含量鑒定提示部分細(xì)胞完成了減數(shù)分裂。

NANOG為胚胎干細(xì)胞自我更新所必需的基因之一，其缺失使得ESC分化[8]。STELLA被認(rèn)為是與抑制體細(xì)胞基因表達(dá)以及卵母細(xì)胞低甲基化有關(guān)的基因[9]。本研究首先誘導(dǎo)POF-iPSC成為PGCLC，再展開減數(shù)分裂的誘導(dǎo)。qPCR結(jié)果顯示，NANOG mRNA相對(duì)表達(dá)水平逐步降低，而抑制轉(zhuǎn)錄因子BLIMP1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平逐漸上升，STELLA mRNA相對(duì)表達(dá)水平于D7最高。另外，OCT4在D7的mRNA相對(duì)表達(dá)水平達(dá)到最高，而在D7或D14，DAZL、DDX4的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均有不同程度的提升。OCT4與PGCLC特異基因DAZL、DDX4激活相關(guān)[8]。免疫熒光染色結(jié)果提示，D7和D14的細(xì)胞中均有表達(dá)DAZL蛋白。本研究從基因和蛋白表達(dá)水平揭示了人iPSC在條件誘導(dǎo)下出現(xiàn)了PGCLC的變化。

減數(shù)分裂是體內(nèi)生殖細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵，而這也是體外誘導(dǎo)生殖配子的難點(diǎn)。SYCP3是存在于聯(lián)會(huì)復(fù)合物中的特異蛋白;γh2AX是表達(dá)于減數(shù)分裂啟動(dòng)階段的蛋白;PRDM9是第1次減數(shù)分裂轉(zhuǎn)錄激活及細(xì)線期的關(guān)鍵基因;而MLH1是減數(shù)分裂中與DNA修復(fù)相關(guān)的基因[10]。上述減數(shù)分裂相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平于D7或D14均發(fā)生了不同程度的提升。與之相符的是，免疫熒光染色結(jié)果中SYCP3于D14組表達(dá)，而PRDM9在D7組及D14組有表達(dá)。這提示分化細(xì)胞最遲在D7可能已經(jīng)開始為減數(shù)分裂作準(zhǔn)備，本研究中D14細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)聯(lián)會(huì)復(fù)合物。

本研究誘導(dǎo)PGCLC的過程參考了Sasaki等[11]的誘導(dǎo)策略，即先誘導(dǎo)形成中胚層前體細(xì)胞，使用了激活物A和GSK-3抑制劑CHIR-99021，再進(jìn)一步誘導(dǎo)形成PGCLC。這是效率較高的人類干細(xì)胞誘導(dǎo)為PGCLC的方法[6， 12]。

Bowles等[13]認(rèn)為，視黃酸是雌性配子發(fā)生減數(shù)分裂的啟動(dòng)因素，并得到后續(xù)多項(xiàng)研究的證實(shí)。其機(jī)制可能是視黃酸啟動(dòng)STRA8基因的表達(dá)，從而使下游的生理過程得以出現(xiàn)。故本研究在培養(yǎng)后期加入視黃酸，刺激細(xì)胞啟動(dòng)減數(shù)分裂。FISH檢測結(jié)果顯示，一部分細(xì)胞胞內(nèi)核膜消失，染色體發(fā)生分離。D14時(shí)有部分細(xì)胞僅展示單個(gè)X染色體著絲粒顯色，提示這些細(xì)胞可能為單倍體細(xì)胞。為證實(shí)此推測，本研究使用碘化丙碇對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA染色以分析DNA的含量。在二倍體細(xì)胞（G0/G1期）DNA含量一半的位置，D14細(xì)胞中出現(xiàn)（2.57±0.07）%的峰形（單倍體細(xì)胞比例），高于D0、D7及對(duì)照組細(xì)胞。以上結(jié)果說明了部分細(xì)胞發(fā)生了減數(shù)分裂。本研究中的POF-iPSC的分化過程與人類生殖細(xì)胞的發(fā)育生理相似。Li等[10]通過對(duì)不同孕周胎兒組織中原始生殖細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序分析，證實(shí)了與這一階段相關(guān)聯(lián)的基因有早期的NANOG、OCT4及稍晚的DAZL和DDX4，這些細(xì)胞標(biāo)志物的分化程度不一。他還指出部分細(xì)胞已經(jīng)具備對(duì)視黃酸的反應(yīng)性，因?yàn)槠浔磉_(dá)了RA信號(hào)通路的基因STRA8，是啟動(dòng)第一次減數(shù)分裂的關(guān)鍵因子。

近年有學(xué)者采用小鼠ESC及iPSC定向分化為卵子，其培養(yǎng)方法可作為人類卵子培養(yǎng)研究的參考，但人類和小鼠卵子發(fā)生過程存在一定差異[3]。Hakabe等[14]將小鼠ESC和iPSC誘導(dǎo)分化為PGCLC，再與卵巢體細(xì)胞體外混合培養(yǎng)約2周后，獲得了成熟的卵子，并成功得到了有生育能力的后代。最近Yamashiro等[6]誘導(dǎo)人類iPSC為PGCLC后，與小鼠胎兒性腺組織共培養(yǎng)4個(gè)月，其中部分細(xì)胞出現(xiàn)了卵原細(xì)胞樣分化，相當(dāng)于剛到達(dá)生殖嵴的原始生殖細(xì)胞。但通過qPCR和免疫熒光染色的檢測，并未發(fā)現(xiàn)其有減數(shù)分裂的相關(guān)基因的表達(dá)和染色體核型的改變。Irie等[8]報(bào)道，人類PGCLC分化的重要調(diào)節(jié)因子是SOX17，其下游表達(dá)的BLIMP1抑制內(nèi)胚層相關(guān)基因的表達(dá)。小鼠是依靠BLIMP1、PRDM14及AP2γ三重基因網(wǎng)絡(luò)共同完成類似的過程，而人類中PRDM14基因在此過程處于相對(duì)不重要的位置。小鼠PGCLC的多能性相關(guān)基因是Sox2，而人類PGCLC并不表達(dá)[15]。這提示我們需重新審視人類卵子體外培養(yǎng)方法。

本研究中，雖iPSC分化后形態(tài)并未發(fā)生卵子樣的改變，但單倍體細(xì)胞的出現(xiàn)提示添加的視黃酸可能是iPSC啟動(dòng)減數(shù)分裂的關(guān)鍵因素。欲使iPSC形態(tài)發(fā)生類卵母細(xì)胞改變，還需卵巢組織樣內(nèi)環(huán)境的調(diào)控，如人類卵巢組織與PGCLC的共培養(yǎng)后是否獲得類卵子樣的改變？這是接下來的研究應(yīng)該關(guān)注的內(nèi)容。

綜上所述，本研究使用了POF-iPSC進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，形成了發(fā)生減數(shù)分裂的單倍體細(xì)胞。本研究減數(shù)分裂的誘導(dǎo)過程為人類雌性配子誘導(dǎo)分化提供了參考，亦為卵巢早衰患者的治療提供了新的思路。有關(guān)人類雌性配子發(fā)育所需要的體外環(huán)境，仍需日后開展研究探討。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Coulam CB， Adamson SC， Annegers JF. Incidence of premature ovarian failure. Obstet Gynecol，1986，67（4）：604-606.

[2] 陳峪，宋曉婕，聶華，曾承，張?jiān)? 卵巢移植技術(shù)的研究進(jìn)展. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2018， 39（1）：26-29.

[3] Hayashi K， Ogushi S， Kurimoto K， Shimamoto S， Ohta H， Saitou M. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice. Science，2012，338（6109）：971-975.

[4] Morohaku K， Tanimoto R， Sasaki K， Kawahara-Miki R， Kono T， Hayashi K， Hirao Y， Obata Y. Complete in vitro generation of fertile oocytes from mouse primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（32）：9021-9026.

[5] Wang JJ， Ge W， Liu JC， Klinger FG， Dyce PW， De Felici M， Shen W. Complete in vitro oogenesis： retrospects and prospects. Cell Death Differ， 2017， 24（11）：1845-1852.

[6] Yamashiro C， Sasaki K， Yabuta Y， Kojima Y， Nakamura T， Okamoto I， Yokobayashi S， Murase Y， Ishikura Y， Shirane K， Sasaki H， Yamamoto T， Saitou M. Generation of human oogonia from induced pluripotent stem cells in vitro. Science，2018，362（6412）：356-360.

[7] Wen Y， He W， Jiang M， Zeng M， Cai L. Deriving cells expressing markers of female germ cells from premature ovarian failure patient-specific induced pluripotent stem cells. Regen Med，2017，12（2）：143-152.

[8] Irie N， Weinberger L， Tang WW， Kobayashi T， Viukov S， Manor YS， Dietmann S， Hanna JH， Surani MA. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell，2015，160（1-2）：253-268.

[9] Li Y， Zhang Z， Chen J， Liu W， Lai W， Liu B， Li X， Liu L， Xu S， Dong Q， Wang M， Duan X， Tan J， Zheng Y， Zhang P， Fan G， Wong J， Xu GL， Wang Z， Wang H， Gao S， Zhu B. Stella safeguards the oocyte methylome by preventing de novo methylation mediated by DNMT1. Nature，2018，564（7734）：136-140.

[10] Li L， Dong J， Yan L， Yong J， Liu X， Hu Y， Fan X， Wu X， Guo H， Wang X， Zhu X， Li R， Yan J， Wei Y， Zhao Y， Wang W， Ren Y， Yuan P， Yan Z， Hu B， Guo F， Wen L， Tang F， Qiao J. Single-cell RNA-seq analysis maps development of hum-an germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell，2017，20（6）：858-873.e4.

[11] Sasaki K， Yokobayashi S， Nakamura T， Okamoto I， Yabuta Y， Kurimoto K， Ohta H， Moritoki Y， Iwatani C， Tsuchiya H， Nakamura S， Sekiguchi K， Sakuma T， Yamamoto T， Mori T， Woltjen K， Nakagawa M， Yamamoto T， Takahashi K， Yamanaka S， Saitou M. Robust in vitro induction of human germ cell fate from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell，2015，17（2）：178-194.

[12] 易寰， 謝冰冰， 劉本， 劉佳， 李敏， 徐莉， 鐘秀風(fēng)， 彭福華. GSK3抑制劑CHIR-99021調(diào)控人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化. 新醫(yī)學(xué)， 2017， 48（4）：217-223.

[13] Bowles J， Knight D， Smith C， Wilhelm D， Richman J， Mamiya S， Yashiro K， Chawengsaksophak K， Wilson MJ， Rossant J， Hamada H， Koopman P. Retinoid signaling determines germ cell fate in mice. Science，2006，312（5773）：596-600.

[14] Hikabe O， Hamazaki N， Nagamatsu G， Obata Y， Hirao Y， Hamada N， Shimamoto S， Imamura T， Nakashima K， Saitou M， Hayashi K. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mou-se female germ line. Nature，2016，539（7628）：299-303.

[15] Perrett RM， Turnpenny L， Eckert JJ， O’Shea M， Sonne SB， Cameron IT， Wilson DI， Rajpert-De Meyts E， Hanley NA. The early human germ cell lineage does not express SOX2 during in vivo development or upon in vitro culture. Biol Reprod，2008，78（5）：852-858.

（收稿日期：2018-12-18）

（本文編輯：林燕薇）