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摘要?目的：建立“小兒化毒膠囊（散）”中游離膽紅素、總膽紅素以及部分膽紅素的HPLC測(cè)定方法，比較以人工牛黃、體外培育牛黃2種牛黃分別投料的小兒化毒散之間差異。方法：分別以二氯甲烷、10%草酸溶液（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）-二氯甲烷、0.2 mol/L乙二胺四醋酸二鈉-二氯甲烷提取樣品中游離膽紅素、部分膽紅素、總膽紅素，用HPLC法測(cè)定，固定相為C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-1%冰乙酸（95∶5），檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min。結(jié)果：膽紅素在5.64～282 ng范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，游離膽紅素、部分膽紅素、總膽紅素平均加樣回收率為90%～95%，RSD分別為4.2%、4.1%和4.9%，2種牛黃投料的小兒化毒散中膽紅素含量及形態(tài)存在明顯差異。結(jié)論：建立的方法可有效識(shí)別“小兒化毒膠囊（散）”中牛黃的投料種類(lèi)，為其他含有牛黃的中藥制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了借鑒。

關(guān)鍵詞?小兒化毒膠囊（散）;人工牛黃;體外培育牛黃;游離膽紅素;總膽紅素;部分膽紅素;高效液相

Study on Bilirubin in Xiaoer Huadu Capsule Made of Different Calculus Bovis

Feng Rui1，Xia Jing1，Pan Jie1，2，Hu Qing1，Mao Xiuhong1，Ji Shen1

（1 Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China; 2 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To establish an HPLC methods for free，portion and total bilirubin in Xiaoer Huadu Capsule（Powder）and compare the difference between 2 types of Calculus Bovis.Methods：The free，portion and total bilirubin were extracted with dichloromethane，10% oxalic acid solution（containing 0.15% cetyltrimethylammonium chloride）-dichloromethane，0.2 mol/L disodium ethylenediaminetetraacetate-dichloromethane，determined by HPLC with C18 column，the mobile phase was acetonitrile-1%glacial acetic acid（95∶5）.The detection wavelength is 450 nm，and the column temperature was 25 ℃.The flow rate was 1.0 mL/min.Results：Bilirubin showed good linear relationship in the range of 5.64 ng-282 ng，and the average recoveries of free，portion and total bilirubin was 90%-95%，with RSD 4.2%，4.1% and 4.9%.There were significant differences in the content and form of bilirubin of 2 kinds of Calculus Bovis.Conclusion：The method established is easy to operate with high effectiveness in identifying bezoar in Xiaoer Huadu Jiaonang and other Chinese traditional patent medicines containing Calculus Bovis.

Key Words?Xiaoer Huadu Capsule（Powder）; Artificial calculus bovis; Cultured calculus bovis in vitro; Free bilirubin; Total bilirubin; Portion bilirubin; HPLC

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.002

“小兒化毒散”現(xiàn)收載于中華人民共和國(guó)藥典2015年版1部，由人工牛黃、珍珠、大黃、雄黃、黃連、甘草、天花粉、川貝母、赤芍、乳香（制）、沒(méi)藥（制）、冰片十二味藥組成，具有清熱解毒、活血消腫的功能，常用于熱毒內(nèi)蘊(yùn)、毒邪未盡所致的口瘡腫痛、瘡瘍潰爛[1]。“小兒化毒膠囊”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方量和制法均保密，經(jīng)團(tuán)隊(duì)調(diào)研發(fā)現(xiàn)該品種是由小兒化毒散改變劑型而來(lái)，且用法、用量以及規(guī)格基本一致，因此對(duì)2個(gè)品種合并研究。

“小兒化毒膠囊”為西安碑林藥業(yè)控股有限公司的獨(dú)家產(chǎn)品，處方中原使用牛黃，2013年向國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局備案藥品注冊(cè)補(bǔ)充申請(qǐng)，使用人工牛黃代替牛黃投料[2]。含有牛黃的經(jīng)典方劑多與雄黃、朱砂等礦物藥配伍，而此類(lèi)方劑的安全性一直以來(lái)受到高度的關(guān)注[3-5]。有研究表明，安宮牛黃丸中牛黃等其他藥味與雄黃配伍后，可降低可溶性砷含量而具有減毒作用[6]，人工牛黃是否可以發(fā)揮出牛黃的作用成為了目前討論的熱點(diǎn)。但是目前中華人民共和國(guó)藥典中“小兒化毒膠囊（散）”現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚無(wú)針對(duì)牛黃的質(zhì)控項(xiàng)目和檢測(cè)手段。因此，建立一個(gè)針對(duì)“小兒化毒膠囊（散）”質(zhì)量控制方法迫在眉睫。

膽紅素是牛黃及其替代品的主要成分之一，近幾年研究發(fā)現(xiàn)其在機(jī)體中發(fā)揮著抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等作用[7-9]，又因?yàn)槟懠t素的性質(zhì)較為特殊，光、熱等多種因素都會(huì)導(dǎo)致其變性[10]，導(dǎo)致分析較為困難，在實(shí)際操作中以游離膽紅素、部分膽紅素（游離膽紅素+結(jié)合膽紅素）和總膽紅素（游離膽紅素+結(jié)合膽紅素+共價(jià)膽紅素）的形式進(jìn)行測(cè)定。本研究根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道[11-15]，通過(guò)對(duì)不同種類(lèi)牛黃投料的“小兒化毒膠囊（散）”中所含膽紅素進(jìn)行研究，分別建立了游離膽紅素、總膽紅素以及部分膽紅素的HPLC法測(cè)定方法，結(jié)合該3種方法可有效控制投料牛黃的質(zhì)量，從而對(duì)“小兒化毒膠囊（散）”質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。并且通過(guò)分析膽紅素的含量[16]，可有效鑒別“小兒化毒膠囊（散）”中牛黃投料的品種。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

Agilent 1100液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司SK8210LHC）;離心機(jī)（Eppendorf 5430R）;旋渦混合器（IKA MS2）。

1.2?試劑

膽紅素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)10077-200503，純度99.0%，使用前無(wú)需處理）;草酸、十六烷基三甲基氯化銨均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙二胺四乙酸二鈉（化學(xué)純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二氯甲烷、冰醋酸均為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，色譜純級(jí)乙腈。

1.3?樣品

由于目前在售和生產(chǎn)的小兒化毒散/膠囊樣品極少，故委托武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司按處方模擬生產(chǎn)體外培育牛黃制和人工牛黃制小兒化毒散各3批，除牛黃品種不同外，其余藥味均采用同一原料;另收集了西安碑林藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的小兒化毒膠囊1批，具體樣品見(jiàn)表1。

2?方法與結(jié)果

2.1?供試品的制備

2.1.1?游離膽紅素含量測(cè)定?取小兒化毒散（批號(hào)：XES-1）研細(xì)，精密稱(chēng)取約210 mg，置錐形瓶中，精密加入二氯甲烷20 mL，稱(chēng)定重量，分別冰浴超聲（功率500 W，頻率53 kHz）30 min，再稱(chēng)定重量，用二氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取二氯甲烷液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算。

2.1.2?部分膽紅素含量測(cè)定?取小兒化毒散（批號(hào)：XES-3）研細(xì)，精密稱(chēng)取約0.12 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入不同體積的0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液，密塞，渦旋均勻，精密加入水飽和二氯甲烷25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，渦旋混勻，冰浴超聲處理（功率500 W，頻率53 kHz）30 min，再稱(chēng)定重量，用水飽和二氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取二氯甲烷液，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算。

2.1.3 總膽紅素含量測(cè)定?取小兒化毒散（批號(hào)：XES-1）研細(xì)，精密稱(chēng)取約0.12 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同體積的10%草酸溶液（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨），密塞，渦旋均勻，精密加入水飽和二氯甲烷25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，渦旋混勻，冰浴超聲處理（功率500 W，頻率53 kHz）30 min，再稱(chēng)定重量，用水飽和二氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（4 000 r/min），取二氯甲烷液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算。

2.3?色譜條件與系統(tǒng)實(shí)用性實(shí)驗(yàn)

2.3.1?檢測(cè)波長(zhǎng)?取膽紅素對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)分光光度掃描，結(jié)果在450 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，對(duì)膽紅素對(duì)照品色譜和供試品色譜中膽紅素色譜峰進(jìn)行二極管陣列掃描，結(jié)果顯示，兩者均在450 nm波長(zhǎng)處有最大吸收且干擾峰極少，故選擇450 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2?色譜條件及專(zhuān)屬性試驗(yàn)?色譜柱：迪馬Diamonsil（5 μm，0.46 cm×15 cm）;流動(dòng)相：乙腈-1%冰乙酸（95∶5）;檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm;柱溫：25 ℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：5 μL。供試品色譜中，具與膽紅素對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，且無(wú)其他成分干擾。空白樣品（缺牛黃）在膽紅素對(duì)照品保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，無(wú)干擾。供試品色譜中，具與膽紅素對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，且無(wú)其他成分干擾?？瞻讟悠罚ㄈ迸｜S）在膽紅素對(duì)照品保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性較好。見(jiàn)圖1。

2.4?耐用性試驗(yàn)

由于不同生產(chǎn)廠家不同牌號(hào)的色譜柱存在填料及性能上的差異，為考察擬訂方法的可行性及通用性，對(duì)1）TSKgel ODS-100V（0.46 cm×25 cm，5 μm）、2）Agilent Eclipse Plus C18（0.46 cm×15 cm，5 μm）、3）Boston Green ODS（0.46 cm×15 cm，5 μm）3根色譜柱進(jìn)行了考察。3根色譜柱均得到的供試品色譜均具與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，且峰形均較對(duì)稱(chēng)、尖銳，對(duì)稱(chēng)因子分別為0.78、1.04、1.12;理論板數(shù)分別為14 933、6 797、6 946。表明擬訂方法通用性較廣。

2.5?膽紅素線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取膽紅素對(duì)照品適量，加二氯甲烷分別制成含膽紅素1.128 μg/mL（ST1）、11.28 μg/mL（ST2）、56.4 μg/mL（ST3）的對(duì)照品溶液。

分別精密吸取ST1溶液5 μL，ST2溶液1 μL、2 μL、5 μL，ST3溶液2 μL、4 μL和5 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明，膽紅素在進(jìn)樣量5.64～282 ng范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。具體見(jiàn)表2。

2.6?重復(fù)性試驗(yàn)

因樣品中游離膽紅素含量太低，因此以加樣回收率來(lái)考察方法重復(fù)性，總膽紅素和部分膽紅素直接考察方法重復(fù)性。

取編號(hào)為2、4的小兒化毒散（含體外培育牛黃，4號(hào)樣品進(jìn)行部分膽紅素測(cè)定）樣品平行制備6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，游離膽紅素、總膽紅素和部分膽紅素的RSD分別為3.1%，4.2%和4.1%，表明重復(fù)性良好。

2.7?穩(wěn)定性試驗(yàn)

參考含牛黃的同系列品種，膽紅素對(duì)照品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

分別取游離膽紅素、部分膽紅素及總膽紅素供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，RSD分別為3%，1.28%，0.17%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8?準(zhǔn)確度試驗(yàn)

2.8.1?游離膽紅素試驗(yàn)準(zhǔn)確度?取2號(hào)小兒化毒散樣品（游離膽紅素含量為0.0398 mg/g）研細(xì)，精密稱(chēng)取約210 mg，一式9份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，每3份為一組，分別精密加入對(duì)照品溶液（6.702 3 μg/mL）20 mL、10 mL、5 mL，精密加入二氯甲烷至20 mL，自“密塞”起同供試品溶液制備，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，準(zhǔn)確度處于85%～105%之間，RSD值小于5%，表明擬訂的游離膽紅素方法準(zhǔn)確度良好。

2.8.2?總膽紅素試驗(yàn)準(zhǔn)確度?取2號(hào)小兒化毒散樣品（含量為4.02 mg/g）研細(xì)，取約0.06 g，一式9份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，每3份為1組，每組分別精密加入對(duì)照品加樣溶液（16.755 75 μg/mL）10 mL、15 mL、20 mL，再分別精密加入水飽和二氯甲烷溶液15 mL、10 mL和5 mL，自“加入10%草酸溶液（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）8 mL”起按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣測(cè)定。見(jiàn)表4。

結(jié)果表明：方法的準(zhǔn)確度處于90.0～110.0%之間，RSD值小于5%，擬定的總膽紅素測(cè)定方法準(zhǔn)確度較好。

2.8.3?部分膽紅素試驗(yàn)準(zhǔn)確度?取4號(hào)小兒化毒散樣品（含量為3.42 mg/g）研細(xì)，取約0.06 g，一式9份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，每3份為1組，每組分別精密加入對(duì)照品加樣溶液（17.436 375 μg/mL）5 mL、8 mL、12 mL，再分別精密加入水飽和二氯甲烷溶液20 mL、17 mL、13 mL，自“加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉5 mL”起按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

結(jié)果表明：方法的準(zhǔn)確度處于90.0～110.0%之間，RSD值小于5%，擬定的部分膽紅素測(cè)定方法準(zhǔn)確度較好。

2.9?樣品測(cè)定

按供試品溶液制備及測(cè)定方法測(cè)定各樣品中游離膽紅素、總膽紅素及部分膽紅素的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

3?討論

3.1?供試品溶液的制備

根據(jù)已有文獻(xiàn)[15]的記載膽紅素易受光、熱和金屬離子的影響而加速分解，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)在避光、冰水浴的條件下進(jìn)行。膽紅素在三氯甲烷中較為穩(wěn)定，但游離膽紅素與結(jié)合膽紅素、共價(jià)膽紅素的性質(zhì)存在差異，當(dāng)親水性較強(qiáng)的結(jié)合膽紅素、共價(jià)膽紅素被解離成游離膽紅素后，脂溶性增強(qiáng)，故選用二氯甲烷作為主溶劑。

為防止金屬離子對(duì)膽紅素提取的影響，還需在溶劑中加入金屬螯合劑對(duì)金屬離子進(jìn)行螯合。根據(jù)共價(jià)膽紅素以及結(jié)合膽紅素的特點(diǎn)，分別選用10%草酸（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）和0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉作為總膽紅素和部分膽紅素的提取螯合劑。此外本研究還對(duì)螯合劑加入體積進(jìn)行了考察，平行取樣8份，分別加入2、5、8、10 mL螯合劑，平行操作進(jìn)行提取，根據(jù)液相中的峰面積及穩(wěn)定性來(lái)篩選最優(yōu)加入體積，最終選擇加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉5 mL，10%草酸（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）8 mL提取部分膽紅素和總膽紅素。

本研究還考察了樣品超聲提取的時(shí)間，平行取樣12份分為6組，分別避光冰浴超聲10、20、30、40、50、60后進(jìn)行提取，根據(jù)液相中的峰面積及穩(wěn)定性來(lái)篩選最優(yōu)超聲時(shí)間，最終選擇超聲處理30分鐘來(lái)提取“小兒化毒膠囊（散）”中的3種膽紅素。

3.2?結(jié)果分析

體外培育牛黃投料的“小兒化毒膠囊（散）”相比于人工牛黃投料的“小兒化毒膠囊（散）”總膽紅素和部分膽紅素含量較高，游離膽紅素含量則符合藥典規(guī)定限量。針對(duì)總膽紅素，中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部中“人工牛黃”膽紅素含量限度為“按干燥品計(jì)算，含膽紅素（C33H36N4O6）不得少于0.63%”，水分限度為不得過(guò)5.0%，方法同為紫外—可見(jiàn)分光光度法。按人工牛黃中牛黃處方量，及液相與紫外—可見(jiàn)分光光度法的差異本品理論含量限度應(yīng)為每g不少于71.4 μg膽紅素（人工牛黃）?？紤]到原料制成制劑的損失，且膽紅素易分解，以理論量的70%制訂含量限度。即“本品每g含人工牛黃以膽紅素計(jì)，不得少于45 μg”。含人工牛黃的3批樣品含量均未達(dá)到限度。對(duì)于體外培育牛黃，根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典有關(guān)含量限度，含體外培育牛黃的4批樣品含量均符合規(guī)定。

人工牛黃投料的小兒化毒散中總膽紅素以及部分膽紅素的含量遠(yuǎn)低于體外培育牛黃投料制劑，因此人工牛黃對(duì)雄黃的減毒作用及其本身的藥效都不及體外培育牛黃?？紤]到處方中含有雄黃，又是小兒用藥，故建議將中華人民共和國(guó)藥典中“小兒化毒膠囊（散）”處方中的人工牛黃重新改為牛黃（包括天然牛黃及體外培育牛黃）。

本研究建立的方法可快速、準(zhǔn)確測(cè)定“小兒化毒膠囊（散）”中的游離膽紅素、總膽紅素和部分膽紅素，可以有效區(qū)分所投牛黃是人工牛黃還是體外培育牛黃，并進(jìn)一步對(duì)投料牛黃進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為其他含牛黃的中藥制劑的質(zhì)量控制提供借鑒。

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