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摘要?目的：采用液相-固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對27種色素建立了準確、靈敏的分析方法。方法：針對脂溶性、酸性和堿性3類色素分別采用不同的制備方法、色譜條件和電噴霧極性，采用4種不同藥用部位的代表性藥材進行了方法學考察。結(jié)果：表明方法線性關(guān)系良好（r≥0.997）;脂溶性和堿性色素的檢測限為0.03～3.87 ng/g，酸性色素為0.003～1.94 μg/g;準確度和精密度分別為70%～105%和0.9%～6.8%;應用于25個品種80批樣品的篩查。結(jié)論：所建方法可靠、高效、準確，適用于中藥材復雜基質(zhì)中不同種類色素的測定。

關(guān)鍵詞?27種;合成色素;脂溶性;酸性;堿性;定性定量;中藥材;UPLC/MS/MS

Qualitative and Quantitative Determination of 27 Synthetic Dyes of 3 Species in Herbs by UPLC/MS/MS

Zhang Su1，2，Hu Qing1，Sun Jian1，F(xiàn)eng Rui1，Yu Hong1，Ji Shen1

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To develop a sensitive and accurate method combining liquid and solid phase extraction with ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry to analyze 27 dyes.Methods：Different preparations，chromatography conditions and polarity of ESI were applied for 3 categories of lipophilic，acidic and basic dyes respectively.Four species of herbs representing different parts of plant were selected for methodology observation.Results：The linear correlation coefficient was good（r ≥ 0.997）.The LODs of oil soluble and basic dyes were 0.03～3.87 ng/g and acid dyes were 0.003～1.94 μg/g respectively.The accuracies and precisions were 70%～105% and 0.9%～6.8% respectively.Conclusion：After detecting 80 samples of 25 species herbs，this method proved to be reliable，efficient and accurate in the detection of different kinds of dyes in the complex matrix of herbs.

Key Words?27 kinds; Artificial dyes; Lipophilic，Acidity; Basicity; Qualitative and quantitative determination; Herbs; UPLC/MS/MS

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.007

中藥主要為天然產(chǎn)物，隨著社會發(fā)展，人們對身體健康愈加重視，市場對中藥的需求不斷增加，價格也水漲船高。由于當前中藥生產(chǎn)、經(jīng)營秩序尚未完全規(guī)范，社會誠信體系缺失，監(jiān)管無法涉及所有環(huán)節(jié)，中藥染色、以劣充好等違法違規(guī)行為仍屢禁不止[1-3]。這些違法行為嚴重危害人民身體健康和生命安全、影響中醫(yī)中藥的聲譽和中醫(yī)藥事業(yè)的健康發(fā)展。特別是合成色素的添加，其特征的偶氮基團（-N=N-）結(jié)構(gòu)，易被腸道菌群還原形成芳香胺類化合物[4]，可引起神經(jīng)毒性[5]、基因毒性[6]以及致癌性[7]。

目前，合成色素的分析方法包括薄層色譜法（TLC）[8]、毛細管電泳法（CE）[9]、離子色譜法[10]、高效液相色譜法（HPLC）[11-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[13-14]、液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法[15-16]等。本實驗室已建立了快速檢測的薄層色譜法，粗略定量和定性的高效液相色譜法[17]以及用于定性的UHPLC-Q-TOF法[18]。這些方法可在不同水平的實驗室用于不同處理過程的色素測定。本文重點闡述利用UPLC/MS/MS對色素同時進行定量和定性分析。對3組色素的流動相和質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，為體現(xiàn)不同基質(zhì)的復雜性，選用4種不同藥用部位的代表性藥材進行了方法學考察。應用該方法對25個品種80批樣品進行了測定，結(jié)果表明該方法靈敏、準確，適用于中藥材基質(zhì)中染色色素的測定。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC/MS/MS），在正、負離子2種采集模式下，對復雜中藥基質(zhì)中的目標化合物進行了鑒定。Waters ACQUITY UPLC I-Class（Milford，Massachusetts，USA）由二元泵（BSM）、進樣器（SM-FTN）和柱溫箱（CM-A）組成，配有AB Sciex API 4000 MS/MS系統(tǒng)（Framingham，Massachusetts，USA），采用Analyst 1.6.1軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.2?試劑?根據(jù)溶解性和酸堿性將色素對照試劑分為3組。見表2。對照試劑的生產(chǎn)廠家包括Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA），Dr.Ehrenstorfer GmbH（Augsburg，German），F(xiàn)luca（Buchs，Switzerland）and和NIFDC（中國國家食品藥品監(jiān)督管理局，北京）。在標簽或分析證書上顯示對照試劑純度均超過80%。提取用甲酸、氨水、乙腈、甲醇為分析級試劑，購自國藥控股化學試劑有限公司（上海）。質(zhì)譜流動相包括甲酸銨，甲酸和乙腈是LC/MS級，購自默克公司（KGaA，Darmstadt，Germany）。

1.3?分析樣品?選取了25種不同顏色的中藥材作為樣本，包括花、莖、根和果實等植物的典型部位。均為市售，包括山茱萸，黃連，丹參，槐米，大黃，制何首烏，烏梅，酸棗仁，醋延胡索，關(guān)黃柏，雞血藤，片姜黃，黃芩，茜草，蘇木，五味子，生蒲黃，紅花，番瀉葉，枸杞子，花椒，青黛，人工牛黃，松花粉，月季花，南五味子。上述前4種中藥材分別作為果實、根、莖、花的代表進行方法學驗證。以上均由上海華宇中藥材材有限公司（中國上海）提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?色譜柱采用Poroshell 120 EC-C18 column（3.0 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent，Palo Alto，CA，USA）。柱溫：40 ℃。正離子掃描模式下，流動相為0.1%甲酸/20 mmol/L乙酸銨溶液（A）-乙腈（B）;負離子掃描模式下，流動相為2 mmol/L乙酸銨溶液（A）溶液-乙腈（B），梯度洗脫程序見表1。流速：0.4 mL/min，進樣體積：1 μL。

2.2?質(zhì)譜條件?采用MRM監(jiān)測脂溶性色素和水溶性堿性色素洗脫液電離后的陽離子，水溶性酸性色素的電離后產(chǎn)生的陰離子。Q1和Q3質(zhì)量分析器的質(zhì)量選擇以單位分辨率為基準。設(shè)定一個子離子用于定量，另一個用于定性。采用氮氣作為離子源氣體1、離子源氣體2、氣簾氣、碰撞氣，流速分別控制在65、60、30、6 psi。電噴霧電壓正離子模式為5 500 V，負離子模式為-4 500 V。離子源溫度：600 ℃。利用27種色素的對照試劑溶液采用流注分析法（FIA）分別對去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）和代表性子離子進行優(yōu)化，其優(yōu)化值見表2。

2.3?供試品溶液

根據(jù)色素的基本結(jié)構(gòu)，對不同色素采用不同的提取和制備方法，以確保色素的純化效率。

脂溶性色素：取藥材粗粉1 g，加乙腈25 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液作為供試品溶液。

水溶性堿性色素：取藥材粗粉1 g，加0.1%甲酸甲醇溶液25 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液5 mL，快速通過聚酰胺小柱（1 g，內(nèi)徑為1 cm，依次用甲醇3 mL和0.1%甲酸溶液3 mL預洗），流速約每分鐘5 mL/min，用60%（v/v）甲醇/水溶液（含0.1%甲酸）5.0 mL以低于5.0 mL/min的流速洗脫。洗脫液離心并用0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

水溶性酸性色素：除提取液（60%（v/v）甲醇/0.1%甲酸）為溶劑外，處理過程與堿性色素提取相同。洗脫溶液更改為8 mL甲醇-氨水-水（v/v，7∶2∶1）。洗脫液加入2 mL的25%甲酸溶液震搖，離心過濾通過0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4?對照試劑溶液

合成色素分成3組（O，B和A），配制濃度約為500 μg/mL的對照試劑儲備液。脂溶性組用乙腈溶解，其他2個水溶性組分別用水溶解。儲備液均保存于-4 ℃，根據(jù)需要稀釋至不同濃度。

2.5?色素的選擇和分組

食品中允許適當使用色素，因此色素的限制重點在禁用的種類和過量使用。但中藥材中的色素情況卻不同。濫用色素的目的是冒充正品或以次充好，導致中藥材偽品質(zhì)量差，影響藥效，甚至對人體有害。因此中藥材中不允許添加色素。

本研究主要針對合成色素，包括報告公布的中藥材中已檢出色素（金胺O，亮藍等），在食品基質(zhì)中報道過的禁用色素（蘇丹系列和羅丹明B等），以及在食品中應用的普通色素（莧菜紅，檸檬黃等）。選取了覆蓋不同色系和不同性質(zhì)色素，以擴大方法的適用范圍。由于所選色素性質(zhì)不同，我們將其分為脂溶性、水溶性堿性和水溶性酸性3類。為了最大限度地提高提取和純化效率，對3組色素采用不同的前處理方案。

2.6?色素的提取

由于色素的溶解性和酸堿性存在差異，因此選用不同的溶劑提取色素。對脂溶性色素通過比較環(huán)己烷和乙腈的影響，最終選擇乙腈作為提取溶劑。對于水溶性色素，含0.1%甲酸的甲醇溶液有助于提取。對于酸性色素，考察了不同比例的甲醇-0.1%甲酸溶液。最終，60%（v/v）甲醇/水溶液（含0.1%甲酸）效果最好。具體內(nèi)容已在我們之前的研究中有所討論[17-18]。

作為中藥材的草本植物通常是干燥的，這與食品基質(zhì)有很大不同。一旦藥材被染色，帶有靜電荷的分子會強烈吸附在藥材纖維上，使得提取非常困難。為了最大限度地提取色素而非提取中藥材中的成分，與振搖、索氏提取和加熱回流進行比較后，選擇超聲處理方式。

2.7?色素的純化

由于中藥材中色素檢測方法報道很少，參考食品中色素的不同純化方法。在多數(shù)情況下，制備方法會根據(jù)目標色素的性質(zhì)進行調(diào)整，如氧化鋁、大孔樹脂、HLB[14]、聚酰胺[11]、離子交換SPE[15，20-21]。其中，由于酰胺基與色素的偶氮結(jié)構(gòu)之間存在氫鍵相互作用，聚酰胺對堿性色素和酸性色素的凈化均有良好的作用。

本文采用商品化的聚酰胺固相萃取小柱，簡化操作步驟，提高結(jié)果重復性。對堿性色素和酸性色素洗脫液pH值進行考察。通過對填料規(guī)格、洗脫溶液比例和洗脫溶劑體積進行優(yōu)化，最終測定條件如2.3所述。

2.8?流動相優(yōu)化

由于脂溶性色素中偶氮鍵的存在以及堿性色素中季銨鹽的存在，含0.1%甲酸的流動相可增強正離子的響應，同時加入乙酸銨后峰形得到改善。流動相不僅在分離方面表現(xiàn)良好，而且對這些化合物的響應也表現(xiàn)良好。但酸性色素不是這樣。由于酸性色素含有硫酸根，緩沖鹽濃度越高，對峰響應的抑制作用越大。當乙酸銨濃度降低到2 mmol/L時，響應增加了約50倍，并且對分離效果和峰形沒有干擾。見圖1。

2.9?母離子和子離子的選擇

所有質(zhì)譜參數(shù)均利用色素對照試劑溶液流注法進行優(yōu)化。我們選擇一個響應強的子離子作為MRM模式的定量離子，另一個作為定性離子。但對于某些酸性色素（亮藍色和亮黃色），由于含有對稱結(jié)構(gòu)和硫酸根導致[M-H]2-穩(wěn)定存在，而不是[M-H]-。所以我們選擇[M-H]2-作為母離子，及其子離子作為配對離子。

2.10?方法驗證

以丹參、山茱萸、槐米、黃連分別代表的果、根、莖、花不同藥用部位進行方法學研究。

2.10.1?線性關(guān)系

線性關(guān)系中脂溶性和堿性色素對照試劑濃度分別為0.05、0.1、1、10、50 ng/mL，酸性色素濃度分別為0.005、0.01、0.1、1和5 μg/mL。以各色素的峰面積對濃度進行線性回歸，并通過計算相關(guān)系數(shù)，對線性回歸方程進行評價。各相關(guān)系數(shù)均大于0.997，說明該方法線性關(guān)系良好。結(jié)果見表3。

2.10.2?檢測限

分別在4個樣品中加入線性標準中最低濃度的對照試劑溶液測定檢測限。以各色素3倍的信噪比（S/N）作為檢測限（LOD），脂溶性和堿性色素檢測限范圍分別為0.03～3.87 ng/g和0.003～1.94 μg/g。由此明顯可以看出負模式的響應比正模式低10～100倍。結(jié)果見表3。

2.10.3?穩(wěn)定性

通過對同一批山茱萸樣品在24 h內(nèi)每隔4 h測定一次，進行穩(wěn)定性分析。采用相對標準偏差（%RSD）作為穩(wěn)定性指標。不同時間色素的峰面積經(jīng)比較差異較小，在1.2%～4.9%之間，說明樣品在測定條件下是穩(wěn)定的。見表3。

2.10.4?準確度和精密度

通過測定加入4種藥材中的對照試劑含量考察方法準確度。添加3個濃度水平的對照試劑計算平均回收率。結(jié)果表明分析方法準確度較好，回收率在70.0%～105%之間（表4）。日落黃和羊毛綠結(jié)果均不佳，尤其是在槐花中。按照該方法對同一樣品重復進樣6次驗證方法精密度。

2.11?應用

從市場中隨機購買25個品種80批中藥材。其中，11個樣品中檢出非法添加色素，檢出率高達13.8%。金胺O是一種高頻檢出色素，常見于大黃、大黃、紅花等黃色和紅色中藥材。金橙II和酸性紅18或73是另外2種常用色素，常見于丹參、紅花等紅色中藥材。在一批紅花樣品中同時檢出了4種色素。亮藍FCF和G是在制何首烏、烏梅等黑色中藥材中首次報道發(fā)現(xiàn)的色素。根據(jù)表5所示的結(jié)果，中藥材中染色色素應引起更多關(guān)注。

3?總結(jié)

通過聚酰胺固相萃取柱純化和UPLC-MS/MS相結(jié)合建立了中藥材中的27種色素準確、靈敏的篩查方法。本方法結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，檢測限符合要求，分析時間短，可用于顏料類的常規(guī)分析。與食品基質(zhì)不同的，中藥材自身干燥，成分復雜，給方法的建立造成一定困難。本方法首次應用于中藥材中的非法添加色素，結(jié)果應引起更廣泛的重視。未來的研究將報道進一步改進后的制備方法和檢測技術(shù)。

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